致泻性大肠杆菌基因芯片检测方法的建立

建立一种多重PCR技术结合基因芯片检测方法,实现多种致泻性大肠杆菌(EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC和大肠杆菌O157)的快速、准确检测。筛选肠致病性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌及大肠杆菌O157的特异基因作为目的基因。设计9对引物和23条探针,进行多重PCR扩增,制备寡核苷酸芯片。将多重PCR扩增产物与带有特异探针的芯片杂交。用扫描仪扫描,判定细菌种类及型别。该基因芯片可特异性的检测EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC和大肠杆菌O157,具有良好的特异性,致病菌检测灵敏度可达104cfu/mL。所建立的多种致泻性大肠杆菌基因芯片方法检测方法特异性好,灵敏度高,具有较好的实用性。     

基于HAND系统5种致腹泻大肠杆菌多重实时PCR初筛方法的建立

以实验室17株种属关系较近的菌株进行特异性评价,通过溶解曲线Tm值对扩增产物进行分析表明,该方法具有高特异性,可同时检出5种致泻性大肠杆菌EAEC(aggR)、EHEC/EPEC (eae)、ETEC (LT)和EIEC(ipaH)的相关毒力基因。粪便模拟样本试验表明,其敏感性达10~4～10~6 CFU/mL。建立的多重实时PCR检测方法适用于5种致泻性大肠杆菌的初步筛选。     

基于HAND系统5种致腹泻大肠杆菌

以实验室17株种属关系较近的菌株进行特异性评价,通过溶解曲线T_m值对扩增产物进行分析表明,该方法具有高特异性,可同时检出5种致泻性大肠杆菌EAEC（aggR）、EHEC/EPEC（eae）、ETEC（LT）和EIEC（ipaH）的相关毒力基因。粪便模拟样本试验表明,其敏感性达10⁴～10⁶ CFU/mL。建立的多重实时PCR检测方法适用于5种致泻性大肠杆菌的初步筛选。     

黑龙江省部分地区原料奶中致泻性大肠杆菌的调查

目的:通过调研黑龙江省部分重要的奶源地区春、夏季的原料奶,确定该地区原料奶中致泻性大肠杆菌的主要类型和相关毒力基因的存在情况.方法:在哈尔滨、绥化和大庆地区的27个奶牛场和奶牛养殖户采集原料奶,通用生化试验和血清学试验,分离鉴定原料奶中的致泻性大肠杆菌并确定相应的血清型.采用多重PCR方法分别检测EPEC和ETEC中eae A与bfp A以及st I与lt I毒力基因的存在情况.结果:从81份原料奶样品中分离、鉴定出致泻性大肠杆菌21株(检出率22.22%),其中EPEC 8株、ETEC 10株和EIEC 3株.经多重PCR检测8株EPEC和10株ETEC,确定它们分别含有eaeA与bfp A以及st I与It I毒力基因.结论:黑龙江省部分重要奶源地区的原料奶均不同程度地被污染了致泻性大肠杆菌,尤以ETEC和EPEC两种类型居多:分离出的ETEC和EPEC分别含有st I与lt I以及eae A与bfp A毒力基因.     

2015—2017年河南省食源性疾病致泻大肠埃希菌监测情况分析

目的 了解河南省食源性疾病致泻性大肠埃希菌(DEC)的致病型和分布情况,为食源性疾病的防控提供参考数据。方法 对哨点医院食源性疾病患者的粪便标本进行DEC检测,确定致病型和毒力基因。结果 4 137份粪便标本有215份DEC阳性,阳性检出率为5.2%,其中有4份标本是不同型别的DEC混合感染。共分离DEC菌株219株,其中肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)156株,产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)28株,肠致病性大肠埃希菌(EPEC)28株,肠出血性大肠埃希菌(EHEC)2株,肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)5株。215例阳性病例中,5岁以下儿童有95例,占比为44.2%。DEC病例在6月和10月有一个发病的高峰,在其他月份均有检出。可疑暴露食品中,由肉与肉制品、乳与乳制品引发的病例分别为34和31例,占比分别为17.3%(34/196)和15.8%(31/196)。结论 河南省食源性疾病DEC基因型中,EAEC占比最高,感染以5岁以下儿童为主,全年均有检出,夏秋季多发,肉与肉制品、乳与乳制品引发病例较多。     

可视化-环介导等温扩增技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H

目的建立可视化的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)联合横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)方法检测肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)0157:H7的分析方法。方法以EHEC 0157:H7的遗传标志性基因z3276基因序列为检测靶标设计6条LAMP特异性引物,其中2条环引物分别标记异硫氰酸荧光素和地高辛,用LFD检测扩增产物,建立EHEC0157:H7 LAMP-LFD检测方法。结果所建立的检测方法能够特异性的检测EHEC 0157:H7,与试验对照菌株EHEC 026、0145、045、0121,及其他主要大肠杆菌血清型025、078、0103、O111、0127、0138、0139、0141,及禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)E058、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)SEC627、EPEC SEC689、K12-MG1655、BL21,和其他种属的受试菌,不存在交叉反应;对EHEC 0157:H7纯培养物的最低检测限为1.3 CFU/mL。结论本研究所建立的LAMP-LFD检测方法特异性和敏感性良好,操作简单,结果可视。     

基于TaqMan探针荧光PCR检测致泻性大肠埃希氏菌

建立快速检测致泻性大肠埃希氏菌的(DEC)方法,根据DEC的uidA (GenBank:JQ068101.1)、bfpB(Sequence:NG_034726.1)、eaeA (GenBank:AJ579305.1)、LT (GenBank:M17873.1)、ST (GenBank:M18346.1)、Stx1 (GenBank:FR875155.1)、Stx2(GenBank:AB030484.1)、ipaH(GenBank:JQ638638.1)、aggR(GenBank:Z32523.1)设计引物和探针,建立基于TaqMan探针荧光PCR检测方法。用uidA基因检测所有DEC,A体系4个基因bfpB、eaeA、LT、ST检测EPEC和ETEC,B体系4个基因ipaH、Stx1、Stx2、aggR检测EIEC、STEC和EAEC,两个体系探针的5′端分别标记FAM、VIC、TET和ROX。试验结果表明,两个体系扩增效率89.6%～102.2%,线性相关系数R2在0.965～0.999范围,可准确鉴别出25株DEC型别,而70株非DEC扩增结果阴性。本研究所建立方法的特异性强,可准确检测EPEC、ETEC、EIEC、STEC和EAEC。     

可视化-环介导等温扩增技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的 建立可视化的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)联合横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)方法检测肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)O157:H7的分析方法。方法 以EHEC O157:H7的遗传标志性基因z3276基因序列为检测靶标设计6条LAMP特异性引物, 其中2条环引物分别标记异硫氰酸荧光素和地高辛, 用LFD检测扩增产物, 建立EHEC O157:H7 LAMP-LFD检测方法。结果 所建立的检测方法能够特异性的检测EHEC O157:H7, 与试验对照菌株EHEC O26、O145、O45、O121, 及其他主要大肠杆菌血清型O25、O78、O103、O111、O127、O138、O139、O141, 及禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)E058、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)SEC627、EPEC SEC689、K12-MG1655、BL21, 和其他种属的受试菌, 不存在交叉反应; 对EHEC O157:H7纯培养物的最低检测限为1.3 CFU/mL。结论 本研究所建立的LAMP-LFD检测方法特异性和敏感性良好, 操作简单, 结果可视。     

多重PCR快速检测两种致泻性大肠杆菌方法的建立

本研究以肠出血性大肠杆菌O157∶H7及肠侵袭性大肠杆菌为目标菌,针对大肠杆菌共同基因uid A、肠出血性大肠杆菌O157∶H7的特异基因O-antigen、肠侵袭性大肠杆菌的特异基因ipa H设计3对引物,建立并优化了检测两种菌的多重PCR检测方法,进行了特异性验证和灵敏度分析,并应用于人工接种新鲜莴苣的检测中。实验结果表明,本研究建立的三重PCR快速检测两种致病菌的检出限为6.3×103CFU/m L,具有较好的灵敏度和特异性。利用所建立的多重PCR方法对人工接种肠出血性大肠杆菌O157∶H7和肠侵袭性大肠杆菌的新鲜莴苣进行检测,检出限为7.8×104CFU/m L。此方法能够对肠出血性大肠杆菌O157∶H7和肠侵袭性大肠杆菌两种食源性致病菌进行快速检测。      

2019年福建省哨点医院腹泻患者中致泻大肠埃希菌感染状况及病原学特征分析

目的 了解2019年福建省哨点医院腹泻患者中致泻大肠埃希菌(DEC)感染状况、毒力基因携带、分子分型及耐药情况。方法 采集腹泻患者210份粪便标本按照GB 4789.6—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》方法分离大肠埃希菌后进行荧光聚合酶链式反应(PCR)确认,并对分离出的DEC进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型及药敏试验。结果 共检出阳性菌株32株,检出率为15.2%(32/210),其中肠道致病性大肠埃希菌(EPEC)占37.5%(12/32),肠道集聚性大肠埃希菌(EAEC)占37.5%(12/32),产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)占25.0%(8/32)。药敏试验结果表明,32株菌对氨苄西林耐药程度最高,耐药率为78.1%(25/32),其次是四环素和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑,耐药率分别为62.5%(20/32)和59.4%(19/32)。多重耐药(MDR)率为50.0%(16/32)。PFGE结果表明,32株菌共分为28种PFGE带型,其中12株EPEC共分为10种带型,12株EAEC共分为10种带型,8株ETEC共分为8种带型,其中EPEC聚类分析结果有两组菌株具有100.0%相似带型,EAEC有一组菌株具有100.0%相似带型,ETEC聚类分析没有完全一致的带型。结论 2019年福建省哨点医院腹泻患者DEC感染主要以EPEC、EAEC为主,菌株分型带型存在多样性,菌株耐药状况严重,且存在较高的多重耐药率。     

5 类致泻性大肠埃希氏菌多重荧光PCR检测方法的建立

目的：建立快速检测和鉴别5?类致泻大肠埃希氏菌的多重实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法。方法：根据5?类致泻大肠埃希氏菌的11?组毒力基因eae、stx1、stx2、ipaH、uidA、estla、estlb、aggR、pic、elt、astA建立多重实时荧光PCR方法,该方法包括A、B?2?个反应体系,可分别检测肠致病性大肠埃希氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、肠产毒大肠埃希氏菌、肠聚集性大肠埃希氏菌,优化反应体系的引物、探针浓度以及PCR反应条件,并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。结果：11?组基因的探针和引物均可特异性地扩增相应的基因片段,A体系检测下限可达到2.6×104?copies/反应,B体系检测下限可到达2.2×104?copies/反应。结论：本研究所建立的多重实时荧光PCR方法可以对同一样本同时采用A、B?2?个反应体系进行检测,不但可以确定待测样本是否为大肠埃希氏菌,而且还能判定其致病型别。为大肠埃希氏菌的临床检测、疾病预防以及爆发溯源等提供参考。     

多重PCR法检测鲜切哈密瓜中3种食源性致病菌

建立可同时检测鲜切哈密瓜中的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。根据单增李斯特菌inl A基因、鼠伤寒沙门氏菌inv A基因、大肠杆菌O157:H7的wzy基因设计3对特异性引物。对多重PCR反应体系中的引物浓度、退火温度、Mg2+浓度、d NTP浓度进行了优化,并确定适宜的多重PCR反应体系及反应条件。结果表明:25μL反应体系,10×PCR buffer为2.5μL,Mg Cl2(25 mmol/L)为3.5μL,d NTPs(2.5 mmol/L)为2μL,inl A基因上下游引物(5μmol/L)为1μL,inv A基因上下游引物(5μmol/L)为1μL,wzy基因上下游引物(5μmol/L)为2μL,单增李斯特菌DNA模板为1μL,鼠伤寒沙门氏菌DNA模板为1μL,大肠杆菌O157:H7 DNA模板为1μL,ex Taq DNA聚合酶(5 U/L)为0.3μL,加dd H2O补足25μL。反应条件为95℃预变性3 min;94℃变性30 s,53.9℃退火30 s,72℃延伸30 s,32个循环;72℃延伸10 min。鲜切哈密瓜中人工接种的目标菌的灵敏度为单增李斯特菌2.7×104 CFU/g,大肠杆菌O157:H7 3.3×104 CFU/g以及鼠伤寒沙门氏菌3.8×104 CFU/g。该技术可为快速检测鲜切哈密瓜中病原菌污染度及其控制提供参考依据。     

傅立叶变换红外光谱技术对6种致病性大肠埃希氏菌快速分型的研究

目的建立肠致病性大肠埃希氏菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)、肠产毒性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(Enteroinvasive E.coli,EIEC)、肠黏附性大肠埃希氏菌(Enteroadhesive E.coli,EAEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(Enterohmorrhagic E.coli,EHEC)、弥散粘附性大肠埃希氏菌(Diffusely adherent E.coli,DAEC)6种致病性大肠埃希氏菌的傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)数据库及FT-IR分型方法。方法应用FT-IR技术对6种致病性大肠埃希氏菌进行指纹图谱数据采集并对其进行基线校正、归一化等处理,应用化学计量学方法对光谱数据进行分析。结果本研究建立了6种致病性大肠埃希氏菌的FT-IR光谱数据库,实现了对6种可疑目标大肠埃希氏菌鉴定;建立了主成分分析(principal component analysis,PCA)和分级聚类分析(hierarchical cluster analysis,HCA)2种模型,成功实现了对6种致病性大肠埃希氏菌的快速分型。结论 FT-IR分析方法快速、简便、易操作,结果重现性好,是一种鉴定6种致病性大肠埃希氏菌的有效方法。     

Diarrheagenic Escherichia coli detected by 16-plex PCR in raw meat and beef intestines sold at local markets in Ouagadougou, Burkina Faso

The study investigated the prevalence of five major Escherichia coli pathogroups in raw meats and beef intestines sold at the local markets in Ouagadougou, Burkina Faso. One hundred and twenty samples (36 beef, 36 beef intestine, 24 mutton and 24 chicken samples) were purchased from four markets between October 2008 and February 2009. Fifteen virulence genes specific for Shiga toxin-producing E. coli (STEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC) and enteroaggregative E. coli (EAEC) were examined using 16-plex PCR for mixed bacterial cultures derived from the samples. One or more diarrheagenic E. coli pathogroup was detected in 51 (43%) of all the 120 samples: in 16 (44%) beef, 19 (53%) beef intestine, 9 (38%) mutton and in 7 (29%) chicken samples. Thirty three (28%) samples were positive for stx(1) and/or stx(2) indicating presence of STEC. EPEC virulence markers (eae, escV and/or ent and/or bfp and/or EHEC-hlyA) were detected in 14 (12%) stx-negative samples. ETEC virulence markers (elt and/or estIb and/or estIa) were detected in 10 (8%) samples and EAEC virulence markers (pic or aggR) in 5 (4%) samples. No EIEC was detected. The results show that in Burkina Faso the microbiological quality of retail meat is alarmingly poor due to the common occurrence of diarrheagenic E. coli bacteria.     

Molecular Methods for Detecting and Discriminating Shigella Associated with Foods and Human Clinical Infections — A Review

There are four species of the genus Shigella: S. dysenteriae, S. flexneri, S. sonneii, and S. boydii. It is extremely difficult if not impossible to utilize the PCR for distinguishing between shigellae and the five diarrheagenic pathotypes of Escherichia coli—enterohemolytic (EHEC), enteropathogenic (EPEC), engteroinvasive (EIEC), enterotoxigenic (ETEC), and enteroaggresive (EAEC)—due to the extremely close genetic relationship between Shigella spp. and E. coli. This problem is magnified by the presence of common virulence plasmids in these two microbial groups with virulence genes of extremely high homology. Although gastrointestinal infections by shigellae and EICC occur most frequently in developing nations, the responsible E. coli strains are indistinguishable from shigellae by PCR. In addition, with the exception of S. boydii, the other three species of Shigella are completely indistinguishable from one another by the PCR. The most fruitful approach to date in attempting to use the PCR for distinguishing the four species of Shigella from one another has been to first use immuno-capture based on somatic O antigenicity immediately prior to the use of the PCR to impart species selectivity to a coupled ELISA-PCR assay system. Most PCR assays involving the detection of shigellae have been designed to detect shigellae plus the E. coli pathotype EIEC as a collective and indistinguishable group of enteroinvasive organisms or to distinguish Shigella from pathogenic members of other pathogenic genera.     

Development of multiplex PCR assays to identify Escherichia coli pathogenic genes in food

In order to rapidly screen for the virulence factor that produces pathogenic Escherichia coli in food, we have developed multiplex polymerase chain reaction (PCR) assays. The multiplex PCR assays detect 4 pathogenic genes of enterohaemorrhagic E. coli (EHEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), and enteroinvasive E. coli (EIEC). This allows for the generation of specific fragments 150, 179, 218, 401, 465, 584, and 881 bp for VT1, ST, LT, 16S rRNA, inV, VT2, and eaeA genes, respectively. The detection limit of 3 log CFU/mL for eaeA, LT, VT1, VT2, 4 log CFU/mL for inV, 6 log CFU/mL for ST by single PCR, while 5 log CFU/mL for VT1, VT2, 6 log CFU/mL for eaeA, LT, 7 log CFU/mL for ST, inV by multiplex PCR. This optimized detection method of pathogenic E. coli can be used as supportive data to revise the microbiological analytical manuals for the Korean Food Code.     

2018-2020年湖州市腹泻人群致泻大肠埃希菌流行特征及病原分析

目的 了解湖州市腹泻人群中致泻大肠埃希菌(DEC)的感染状况、主要毒力基因以及耐药情况.方法 对2018-2020年各哨点医院腹泻患者粪便标本进行分离,采用多重荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法对DEC分离株进行毒力基因检测,用微量肉汤稀释法进行药敏试验.结果 共检出DEC阳性病例293例,分离菌株294株.肠集聚性大...