as1-酪蛋白IgE抗原决定簇的识别

以αs1- 酪蛋白氨基酸序列为模板,错位合成αs1- 酪蛋白多肽,以收集到的牛乳过敏患者血清为抗体,鉴定αs1- 酪蛋白IgE 抗原决定簇,分析影响致敏性的关键氨基酸,探讨牛乳过敏机理。结果表明：αs1- 酪蛋白IgE 抗原决定簇有5 条,它们在αs1- 酪蛋白的定位分别为aa21～35、aa26～40、aa91～105、aa141～155、aa186～200。影响αs1- 酪蛋白致敏性的关键氨基酸为组氨酸、谷氨酸、脯氨酸。说明特异性水解抗原决定簇或定点修饰过敏原氨基酸实现脱敏的方法是可行的。     

牛乳α-乳白蛋白IgE线性表位的关键氨基酸识别

α-乳白蛋白是引起牛乳过敏的主要过敏原之一。识别α-乳白蛋白作用表位及影响致敏性的关键氨基酸,对于揭示α-乳白蛋白致敏机理及低致敏乳制品的开发具有重要的意义。本研究采用固相合成技术合成α-乳白蛋白系列多肽,以牛乳过敏患者血清为探针,通过酶联免疫吸附分析法识别α-乳白蛋白的作用表位和关键氨基酸。结果表明:免疫球蛋白(immunoglobulins,Ig)E作用表位的氨基酸序列定位为aa1-15、aa6-20、aa46-60、aa71-85和aa101-115。α-乳白蛋白IgE作用表位关键氨基酸为第8位的缬氨酸、第9位的苯丙氨酸、第10位的精氨酸、第103位的酪氨酸、第105位的亮氨酸和第107位组氨酸。本研究可以为过敏原c DNA克隆以激活T细胞、降低IgE结合能力提供重要思路。     

牛乳中主要过敏原组分的分离纯化及鉴定

目的:分离纯化并鉴定牛乳中引起过敏反应的主要致敏组分。方法:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)分析了脱脂乳和乳清的蛋白组分,用饱和硫酸铵分段盐析-DEAE离子交换柱层析纯化过敏原蛋白,脱脂乳和乳清蛋白皮下注射Balb/c小鼠获得高效价特异性IgE抗血清用于免疫印迹分析。结果:免疫印迹分析显示β-乳球蛋白(β-Lg)是引起牛乳过敏的主要过敏原,建立了牛乳过敏小鼠模型。结论:明确了牛乳过敏的主要过敏组分,对牛乳过敏症的诊断治疗以及无过敏原牛乳的制备提供了实验依据。     

水牛乳中主要过敏原的分离纯化

牛乳和水牛乳存在免疫交叉反应,牛乳过敏患者可能对水牛乳过敏。因此,分离纯化出水牛乳中各种过敏原将为进一步的工作奠定物质基础。实验中以摩拉水牛乳为原料,通过等电点沉淀、凝胶柱层析法和阴离子交换法分离纯化水牛乳的酪蛋白、β-乳球蛋白α-乳白蛋白,得到了SDS-PAGE纯(纯度≥90%)的β-乳球蛋白α-乳白蛋白。离子交换层析分离β-乳球蛋白、α-乳白蛋白的得率分别为50.26%、52.86%;凝胶层析分离β-乳球蛋白、α-乳白蛋白的得率分别为49.39%、84.19%。实验结果表明,等电点沉淀、凝胶柱层析法和阴离子交换法适合于分离水牛乳中主要过敏原成分。     

花生过敏原Ara h1免疫显性抗原决定簇的鉴别

为探索花生过敏原致敏机理,采用固相合成肽技术合成Ara h1的23条多肽。以花生过敏患者血清为抗体,鉴别和定位Ara h1的抗原决定簇。结果表明:Ara h1第21～34位,第89～98位,第393～403位,第498～507位,第594～605位氨基酸序列识别率在60%以上,为Arah1的抗原决定簇,其中第498～507位的多肽识别率为100%,是显性抗原决定簇,其氨基酸序列为RRYTARLKEG。用丙氨酸依次取代显性抗原决定簇的每个氨基酸,结果抗原决定簇的致敏性增强或丧失,说明Ara h1第499位和第503位的精氨酸和第502位的丙氨酸为降低Ara h1致敏性的关键氨基酸。     

山羊乳与牛乳配方乳粉的致敏性比较

山羊乳是一类营养丰富且易于消化的乳品,因其营养成分与牛乳相近而受到广泛关注。本研究通过蛋白质潜在致敏性树状评估策略（生物信息学、消化稳定性、血清学研究、动物模型）对山羊乳配方乳粉的致敏性进行评价,并研究山羊乳配方乳粉与牛乳过敏患者血清中免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）E之间存在的交叉反应性。结果表明,山羊乳配方乳粉的167 种蛋白质中,β-乳球蛋白和α-乳清蛋白含量显著低于牛乳配方乳粉（P＜0.05）,山羊乳配方乳粉在模拟胃液中更易消化,且与过敏患者血清的结合能力弱于牛乳配方乳粉,动物模型结果表明山羊乳配方乳粉致敏小鼠体温下降幅度、临床过敏症状评分、血清中特异性IgE和IgG1抗体水平、血浆中组胺水平、血管渗透性及组织炎症程度等均显著低于牛乳配方乳粉组致敏小鼠（P＜0.05）,交叉反应性结果表明山羊乳配方乳粉能与牛乳过敏患者血清结合,但结合能力明显低于牛乳配方乳粉。结论：与牛乳配方乳粉相比,山羊乳配方乳粉的致敏性较弱,可作为牛乳的替代品,降低牛乳过敏性疾病的发病风险。     

具有T细胞口服免疫耐受作用的β-乳球蛋白水解物的制备及鉴定

以牛乳中主要过敏原β-乳球蛋白为研究对象,制备和鉴定具有T细胞表位和口服免疫耐受性的水解物,旨在为牛乳过敏患者口服免疫治疗方法提供理论依据。采用生物信息学方法预测β-乳球蛋白的T细胞表位,通过质谱分析6种蛋白酶水解β-乳球蛋白水解物的氨基酸序列,用T细胞增殖实验鉴定水解物中多肽免疫耐受作用,体内实验测定小鼠血清特异性抗体(IgE、IgG₁、IgG_2a)、Th1细胞因子(IFN-γ、IL-17)、Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)、组胺、几丁质酶-3样蛋白1的水平及小鼠脾脏细胞亚群的变化水平,验证β-乳球蛋白水解物的口服免疫治疗活性。研究结果表明：胰蛋白酶、复合蛋白酶和木瓜蛋白酶水解物具有口服耐受性,其中复合蛋白酶和木瓜蛋白酶水解物具有口服耐受性是创新性发现。中性蛋白酶水解物虽然含有T细胞表位,但是仍然具有致敏性。因此含有T细胞表位的水解物不一定具有口服免疫耐受性,需要体内实验验证。研究结论以期为新型抗过敏乳基料的开发和临床治疗牛乳过敏提供参考数据。     

牛乳乳清中主要过敏原的B细胞表位定位

采用噬菌体展示技术结合生物信息学定位牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的B细胞表位,分析不同类型表位之间的氨基酸组成和空间分布规律。结果表明,某些线性表位是构象性表位的组成部分,IgE与IgG表位存在共同区域。本研究得到的表位是牛乳过敏诊断和预后的候选生物标志物,也可用于指导于低致敏性乳制品的开发。     

牛乳过敏原及加工技术对其致敏性的影响

对婴幼儿来说,牛乳营养丰富,是母乳最好的替代品,但牛乳中的蛋白质可能会引起过敏。牛乳中的主要过敏原是酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。本文从牛乳过敏原的结构和抗原表位、热处理、发酵和酶处理等不同的加工技术对牛乳蛋白致敏性的影响和过敏原标记检测方法三个方面进行了综述,为开发低致敏牛乳制品提供借鉴。     

牛乳α-乳白蛋白免疫球蛋白G线性表位的关键氨基酸识别

α-乳白蛋白是牛乳中的主要过敏原,开展α-乳白蛋白表位定位及氨基酸特性研究可深入了解过敏原的致 敏机理,有助于更好地认识免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）在乳过敏反应中的作用,为制备低过敏乳制 品提供理论指导。本研究采用丙氨酸免疫表位扫描技术识别α-乳白蛋白的关键氨基酸,即用牛乳过敏患者血清中 IgG识别α-乳白蛋白系列合成的多肽,筛选作用表位,然后用丙氨酸依次取代作用表位的氨基酸合成新的多肽,以 牛乳过敏患者血清池为抗体识别关键氨基酸。结果表明：α-乳白蛋白IgG作用表位的氨基酸序列定位为aa6～20、 aa21～35、aa36～50和aa86～100;关键氨基酸为第9位的苯丙氨酸、第15位的亮氨酸、第24位的脯氨酸、第26位的 色氨酸和第32位的组氨酸。     

核桃中主要过敏原Jug r 1 B细胞线性表位中关键氨基酸的免疫信息学预测和识别

为确定影响Jug r 1线性表位致敏性的关键氨基酸,研究2 种免疫信息学方法预测Jug r 1线性表位关键氨基酸的准确率和效率,以进一步认识核桃主要过敏原Jug r 1的B细胞线性表位。本研究通过2 种免疫信息学的方法对Jug r 1中3 个线性表位上的关键氨基酸进行预测,采用丙氨酸扫描诱变法对关键氨基酸进行识别,采用固相合成技术合成Jug r 1系列突变多肽,以部分中国核桃过敏患者血清为探针,识别Jug r 1关键氨基酸。结果表明：表位1（4LVALLFVANAAA15）中的第4位亮氨酸、第7位亮氨酸、第8位亮氨酸和表位2（16FRTTITTMEIDEDID30）中的第20位异亮氨酸、第21位苏氨酸、第22位异亮氨酸以及表位3（125CGISSQRCEIRRSWF139）中的第127位异亮氨酸、第129位丝氨酸、第130位谷氨酰胺为关键氨基酸。使用两种免疫信息学结合预测的关键氨基酸准确率达到100%,但预测效率仅为11%。因此,使用2 种免疫信息学结合的方式预测表位关键氨基酸可提高准确性,但会忽略一些关键氨基酸。免疫信息学结合丙氨酸扫描诱变法是识别表位关键氨基酸的重要研究思路。     

Identification of the critical amino acid residues of immunoglobulin E and immunoglobulin G epitopes on αs1-casein by alanine scanning analysis

α_s1-Casein represents one of the major allergens causing cow milk allergy. Few studies have clearly evaluated immunological relationships between IgE- and IgG-binding epitopes of α_s1-casein. This study aimed to map IgE- and IgG-binding epitopes of α_s1-casein by the serology method, and identify the critical amino acids of α_s1-casein by alanine scanning analysis. Our initial data revealed IgE-binding epitopes located in the sequences of AA 126 to 140, AA 6 to 20, AA 171 to 185, and AA 11 to 25. The sequences at AA 21 to 35, AA 56 to 70, and AA 161 to 175 were recognized by IgG antibodies. The alanine scanning analysis showed that IgE- and IgG-binding epitopes share the same critical AA: arginine at position 22 and phenylalanine at position 23. Results obtained from this study will provide necessary information to alter the cDNA to encode a protein with reduced IgE- or IgG-binding capacity.     

鸡蛋致敏原溶菌酶的B细胞IgG线性表位定位

目的 探究鸡蛋致敏原溶菌酶的B细胞线性表位。方法 先使用DNAStar、Immunomedicine Group、BepiPred、Bcepred和ABCpred对其氨基酸序列分析,预测其潜在的B细胞线性表位,同时合成覆盖其完整氨基酸序列的重叠肽,然后利用斑点杂交法筛选出与抗溶菌酶兔血清IgG特异性结合的多肽片段,从而定位出溶菌酶的B细胞IgG线性表位。结果 通过生物信息学工具综合分析预测出了鸡蛋溶菌酶的4个B细胞线性表位,分别为AA18～21(DNYR)、AA39～51(NTQATNRNTDGST)、AA62～78(WWCNDGRTPGSRNLCNI)、AA109～117(VAWRNRCKG);利用dot-blot定位出5个鸡蛋溶菌酶的B细胞IgG线性表位,分别为AA1～15(KVFGRCELAAAMKRH)、AA28～30 (WVC)、AA70～78 (PGSRNLCNI)、AA103～117 (NGMNAWVAWRNRCKG)、AA124～126 (IRG)。研究结果表明,采用生物信息学工具预测的B细胞线性表位与已知的溶菌酶的B细胞IgE线性表位的重合率达75%,与用dot-bl...     

Genetic variants of bovine β- and κ-casein result in different immunoglobulin E-binding epitopes after in vitro gastrointestinal digestion

Immunoglobulin E-mediated allergy to cow milk is a common allergy in industrialized countries, mainly affecting young children and infants. β-Casein (CN) and κ-CN belong to the major allergens in cow milk. Within these milk proteins, genetic polymorphisms occur, which are characterized by substitutions or deletions of AA, resulting in different variants for each protein. Until now, these variants have not been considered when discussing the allergenic potential of bovine milk. In this study, the focus was placed on the arising peptide pattern after in vitro gastrointestinal digestion of several β- and κ-CN variants to determine resistant fragments containing IgE-binding epitopes and to identify potential differences between these variants. β-Casein A¹, A², and B, as well as κ-CN A, B, and E, were separated and isolated from milk of cows homozygous for these variants and digested with an in vitro gastrointestinal digestion model. The resulting peptides were identified using mass spectrometry and compared with previously determined epitopes. Seven β-CN and 4 κ-CN peptides, common in all β- or κ-CN variants, remained of sufficient size to harbor IgE-binding epitopes. In addition, some peptides and, consequently, epitopes differ from each other due to the AA substitution occurring in the individual variants. The distinct peptides AA 108 to 129 of β-CN A¹ and A², AA 103 to 123 of β-CN B, as well as AA 59 to 72, AA 59 to 80, and AA 58 to 80 of all 3 β-CN variants correspond to the IgE-binding epitopes AA 107 to 120 and AA 55 to 70, respectively. In κ-CN, the 2 variant-specific peptides AA 136 to 149 (κ-CN A, E) and AA 134 to 150 (κ-CN B) are congruent with the IgE-binding epitope AA 137 to 148. The present study shows that genetic polymorphisms affected the arising peptide pattern of the caseins and thus modifications in the IgE-binding epitopes occurred. As a consequence, the casein variants could show differences in their allergenicity. Studies investigating the allergenic potential of these different peptides are currently in progress.     

Epitopes resistance to the simulated gastrointestinal digestion of β-lactoglobulin submitted to two-step enzymatic modification

The effects of β-lactoglobulin (βLg) hydrolysis with alcalase or bromelain and its association with polymerization by transglutaminase (TG) on both the protein antigenicity and resistance of epitopes to in vitro digestion were investigated. Despite the polymerization with TG altered the gastric and gastrointestinal (GI) digestion patterns of the hydrolysates with bromelain, no changes were observed with alcalase. Before and after in vitro digestion, native βLg showed the highest IgE-binding capacity, evaluated using sera from milk-allergic patients, while the enzymatic treatments—associated or not—reduced the βLg antigenicity response. Seven and four epitopes were found after gastric and GI digestion of native βLg, respectively. After gastric digestion of the hydrolysates with bromelain, two epitopes were identified, being Tyr₄₂–Leu₅₄ resistant to GI digestion. No epitope was found in GI digested products of hydrolysates with alcalase. Hydrolysis associated or not with polymerization reduced the number of epitopes and the IgE-binding capacity of the samples.     

动态高压微射流协同糖基化对β-乳球蛋白乳化性和结构的影响

采用动态高压微射流（dynamic high pressure microfluidization,DHPM）协同糖基化处理β-乳球蛋白,研究改性β-乳球蛋白乳化性、乳化稳定性和结构的变化。研究发现DHPM协同糖基化处理过程中β-乳球蛋白结构变化与其乳化性能可能存在关联;DHPM协同糖基化处理能显著提高β-乳球蛋白的乳化性和乳化稳定性。0、40、120 MPa糖基化处理后β-乳球蛋白的乳化活性指数（emulsifying activity index,EAI）分别为136.3、168.1、177.9 m2/g。0 MPa协同糖基化处理后β-乳球蛋白的乳化稳定指数（emulsifying stability index,ESI）为52.3 min;随着压强逐渐增加至40 MPa和120 MPa,协同糖基化处理后ESI值分别升高为56.4 min和59.0 min。通过表征分析β-乳球蛋白结构变化发现：不同压力DHPM协同糖基化处理后,β-乳球蛋白分子质量升高;巯基含量升高;表面疏水性降低;二级结构变化以及氨基酸三维空间构象暴露程度发生变化。这些变化说明β-乳球蛋白与低聚半乳糖发生共价交联时改变了蛋白质结构,造成β-乳球蛋白表面亲水基团的增加,从而导致其乳化性能显著提高。     

间接竞争ELISA法检测牛乳中β-乳球蛋白含量的准确性评价

研究建立了以β-乳球蛋白标准品为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG:HRP为二抗、邻苯二胺为底物的间接竞争酶联免疫检测法(indirect competitive enzyme-linked immu nosorbent,ELISA)。同时以反相高效液相色谱法定量检测相同样品中β-乳球蛋白含量,采用t检验方法来评价间接竞争ELISA的方法定量检测β-乳球蛋白的准确性。t检验方法结果显示:在显著水平α=0.05下,该间接竞争ELISA法检测β-乳球蛋白的测量值较为准确。