人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析

胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。     

樟绒枝霉α-淀粉酶在毕赤酵母中的高效表达及在麦芽糖浆制备中的作用

从嗜热真菌樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)中克隆α-淀粉酶基因McAmyA,并在毕赤酵母GS115中高效表达,经高密度发酵至168 h时,胞外酶活力达到13 440. 6 U/mL。重组α-淀粉酶McAmyA粗酶液经QSFF强阴离子交换层析纯化得到电泳级纯酶,比酶活力为1 230. 2 U/mg。酶学性质研究表明,重组α-淀粉酶McAmyA的最适pH和最适温度分别是6. 5和65℃。以淀粉液化液为底物,在温度60℃,加酶量120 U/g,水解24 h的条件下,重组α-淀粉酶McAmyA水解液化液,制备得到麦芽糖含量为50. 0%(质量分数)的麦芽糖浆。该真菌α-淀粉酶在毕赤酵母中表达水平高,具有很大的应用潜力。     

小菜蛾moricin在毕赤酵母中的表达及抑菌活性分析

抗生素的过度使用给自然生态带来诸多不利影响,寻找合适的抗生素的替代物,从而减少抗生素的使用正成为当下的研究热点。以来自于小菜蛾的特异性抗菌肽moricin为研究对象,研究其酵母异源表达水平和抑菌性能及生化特性,为进一步的开发利用提供理论支持。根据已有的小菜蛾抗菌肽moricin特异性基因信息,采用聚合酶链式反应扩增其成熟肽基因mor-3,并克隆至pGAPZαA质粒中,构建组成型分泌表达载体pGAPZαA-mor3,线性化片段电转化导入毕赤酵母SMD1168菌株,高质量浓度Zeocin筛选获得高拷贝重组转化子。以YPD为培养基进行摇瓶发酵,重组蛋白获得高效表达,分子质量约为5kD,与理论预测的基本一致;发酵60 h,上清液中重组蛋白表达量达248.98 mg/L,而且耐热性能良好,同时具备较强的耐强酸及强碱的能力,特别在强酸环境中活性保持稳定,体现了较好的机体内环境的适应性潜力;对部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有抑菌作用,特别是对革兰氏阴性菌具备特异性较强的抑制作用,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为6.25μg/mL,而对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度仅为124.49μg/mL。独特的抑菌性能和理化特点,使其具备广阔的开发应用前景及良好的社会与环保效益。     

麦芽糖转糖基酶产环糊精性质的研究

通过β-淀粉酶对未环化的直链淀粉进行降解,采用DNS法对反应体系中还原糖进行测定,依据环化反应前后还原糖的变化来计算环糊精的产率,研究底物浓度、酶量、温度、pH、麦芽糖、乙醇、二甲基亚砜对转化率的影响。结果表明,直链淀粉终浓度为0.1～0.125%时转化率最高,而酶用量对最终转化率影响不大,最适转化pH值和温度分别是6.5和40℃,麦芽糖对转化率起抑制作用,乙醇和二甲基亚砜则能够提高转化率。     

重组枯草芽孢杆菌素subtilosin A基因的合成及其在毕赤酵母中的表达

人工改造并合成subtilosin A的结构基因(rsbo A),并在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白。结果表明:经阳性大肠杆菌转化子菌落PCR和测序鉴定,表明重组质粒p PIC9K-sbo构建正确;经阳性酵母转化子的菌落PCR产物电泳检测,可见清晰目的基因条带,证明重组酵母GS115-p PIC9K-sbo构建正确;经枯草芽孢杆菌素蛋白电泳检测,可见明显蛋白条带,表明重组rsbo A基因在毕赤酵母GS115中获得了分泌表达。在抑菌效果检测中,重组酵母工程菌的发酵液对铜绿假单胞菌具有一定的抑菌活性。本研究开创了有望替代抗生素的小分子肽细菌素异源表达新思路,为枯草芽孢杆菌素subtilosin A的工业化生产奠定了基础。     

重组枯草芽孢杆菌素subtilosin A基因的合成及其在毕赤酵母中的表达

人工改造并合成subtilosin A的结构基因（rsbo A）,并在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白。结果表明:经阳性大肠杆菌转化子菌落PCR和测序鉴定,表明重组质粒p PIC9K-sbo构建正确;经阳性酵母转化子的菌落PCR产物电泳检测,可见清晰目的基因条带,证明重组酵母GS115-p PIC9K-sbo构建正确;经枯草芽孢杆菌素蛋白电泳检测,可见明显蛋白条带,表明重组rsbo A基因在毕赤酵母GS115中获得了分泌表达。在抑菌效果检测中,重组酵母工程菌的发酵液对铜绿假单胞菌具有一定的抑菌活性。本研究开创了有望替代抗生素的小分子肽细菌素异源表达新思路,为枯草芽孢杆菌素subtilosin A的工业化生产奠定了基础。      

大肠杆菌植酸酶AppA在毕赤酵母中的高效表达

本研究全基因合成大肠杆菌B48来源的植酸酶AppA基因,并将它克隆到PHKA载体上,在毕赤酵母GS115中进行分泌表达。为了进一步提高毕赤酵母中植酸酶的表达量,本研究结合信号肽、启动子、基因剂量和蛋白质折叠通量优化的方法,最终将毕赤酵母中植酸酶的活力从329.41 U/mL提高到了1892.51 U/mL,是初始菌株的5.75倍。初步测定了植酸酶AppA的基本酶学性质,其最适温度和pH分别为60 ℃和4.5;在60 ℃处理60 min后,植酸酶活力剩余40%,温度稳定性较差;在pH 6.0~7.0处理6 h后,酶活力剩余87%,该酶在弱酸环境中有较好的稳定性;同时研究了二价金属离子对植酸酶活力的影响,Fe2+能够激活植酸酶AppA的活力,而Cu2+、Ni2+、Mn2+等离子通过与植酸形成络合物而抑制植酸酶AppA的活力。该酶在酸性条件下的强稳定性有利于将其应用于食品加工领域。     

纳豆激酶基因在毕赤酵母中的表达条件研究

通过设计正交试验,对重组Pichiapastrois酵母利用YEPD培养基表达纳豆激酶基因的发酵条件进行了研究,确定最适条件:pH值6·0,培养温度30℃,培养时间36h,诱导时间84h,甲醇添加量1·0%,其中培养温度为主要影响因素。在该条件下进行重组子的培养及诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%。     

重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的优化表达及疫苗活性研究

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要致病原,在全世界范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒2型Cap蛋白(PCV2-Cap)是制备猪蓝耳病疫苗的主要靶蛋白。针对目前PCV2疫苗生产工艺复杂、成本较高的问题,本研究利用毕赤酵母表达系统研究PCV2-Cap蛋白的重组表达及疫苗活性,将PCV2-Cap基因序列去除核定位信号序列(NLS)后,经密码子偏好性优化,构建重组表达载体,并转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经Zeocin抗性筛选获得重组菌株。SDS-PAGE和Western blot结果显示Cap蛋白在酵母表达系统中成功表达,蛋白质大小为26 ku。5 L罐高密度发酵小试,得到PCV2-Cap蛋白在发酵上清液中的浓度约为0.53 mg/m L,占总蛋白的23.5%。动物免疫试验显示重组Cap蛋白能刺激机体产生特异性抗体。结果表明,PCV2-Cap基因在毕赤酵母中实现了分泌表达,为PCV2-Cap毕赤酵母亚单位疫苗的研制提供了数据支持。     

海藻糖合酶基因在毕赤酵母中的表达

首次构建来源于恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因（AE015451.1）的真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达。PCR扩增目的基因,经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的pPICZaA中,经PCR检测和序列测定准确后,通过电击法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中,利用含Zeocin的YPD平板筛选到阳性转化子,提取阳性转化子基因组并利用特异性引物PCR得到一条与目的基因大小相同的条带,说明目的基因转入成功,诱导重组蛋白表达并用SDS-PAGE检测可见一条约76 ku与目的蛋白大小预测相符合的蛋白条带,最后HPLC检测重组蛋白可将麦芽糖特异转化为海藻糖,说明外源表达的海藻糖合酶具有一定酶活。通过PCR、SDS-PAGE和HPLC结果说明成功构建重组pPICZaA-TreS质粒并整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,且海藻糖合酶基因得到预期的表达并具有活性,为下一步研究奠定基础。     

牛乳铁蛋白肽衍生物的设计及其在毕赤酵母中表达与活性分析

本文利用抗菌肽数据库以及蛋白质分析软件等工具,根据抗菌肽结构与功能的关系,对牛乳铁蛋白肽衍生肽(LfcinBD)的结构进行优化设计。将设计得到的LfcinBD基因片段与pPIC9K质粒构建重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母细胞GS115,利用甲醇诱导表达。实验对发酵上清液进行了分离纯化和活性测试,SDS-PAGE电泳检测到了目标蛋白的有效表达。实验还对优化设计得到的牛乳铁蛋白肽衍生肽与同等发酵条件下产生的天然牛乳铁蛋白肽的抑菌活性进行了对比分析,结果证明该衍生肽对金黄色葡萄球菌有更强的抑菌活性。研究表明经色氨酸Trp替换的牛乳铁蛋白肽中第10,14位氨基酸获得的牛乳铁蛋白肽衍生肽具有很好的抑菌活性,实验为进一步探究牛乳铁蛋白肽衍生肽生物活性的改进奠定了基础。     

cp4-epsps基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

为建立一种新的外源蛋白安全评估方法,构建转外源基因酵母是关键步骤。本研究以来源于转基因作物的抗除草剂合成酶蛋白CP4-EPSPS为研究模板,首先通过基因优化和化学合成获得cp4-epsps基因,优化后基因密码子适用性指数(CAI)为0.85,GC含量为52%。目的基因克隆至毕赤酵母表达载体p PICZb,经鉴定筛选正确的重组载体p PICZb-EPSPS电击转化至毕赤酵母GS115,cp4-epsps基因通过同源重组方式整合至酵母基因组,PCR扩增酵母基因组筛选得到在正确位点发生同源重组的4株阳性菌株。随后,各阳性菌株分别于28℃、250~300 r/min培养,0.5%甲醇诱导4 d后,提取各组菌株总蛋白,采用SDS-PAGE和western blotting鉴定CP4-EPSPS表达的正确性。CP4-EPSPS单克隆抗体及载体标签C-MYC单克隆抗体的western blotting结果一致显示cp4-epsps基因在毕赤酵母GS115中成功获得表达,大小约50 ku。本实验成功构建了转cp4-epsps基因的毕赤酵母基因工程菌,为下一步开展转基因作物CP4-EPSPS成份的安全评价奠定基础。     

重组牙鲆生长激素基因片断在毕赤酵母中的表达

为了开发一种有效的重组牙鲆生长激素(r-fGH)的方法,利用PCR的方法从牙鲆eDNA文库中克隆得到了牙鲆生长激素(fgh)的cDNA片断.接着将这个fgh片断克隆到整合型质粒pAO815,它可以在甲醇诱导启动子的调控下表达外源蛋白.利用这种包含一个fgh插入片段的克隆来构建含有2个和3个头尾顺序排列的fgh表达框的表达质粒.利用氯化锂转化的方法将所构建的质粒转化到毕赤酵母GS115,然后进行筛选、培养和0.5%甲醇诱导表达,最后得到重组表达的牙鲆生长激素.     

甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的分泌表达

本研究采用毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度Monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9M,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度Monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M.通过PCR检测证实Monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Western blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白存在正常活性.     

Coprinopsis cinerea 漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

本文通过RT-PCR从Coprinopsis cinerea okayama7#130中克隆得到laccase1,应用SignalP3.0Server软件分析其氨基酸序列后设计不含信号肽序列的新引物扩增得到不含信号肽的漆酶基因1（lac1）,并构建重组酵母表达载体pPIC9K-lac1,电击转化毕赤酵母GS1115并用甲醇诱导表达,之后研究重组酶的酶学性质。克隆得到的laccase1全长为1593bp,编码530个氨基酸,其中信号肽包含18个氨基酸。SDS-PAGE显示重组蛋白大小约为65KDa。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为45℃,最适pH为4.3。重组漆酶在45℃保存3h后活性基本保持不变,在pH4.0～10.0的范围内稳定性较好。成功分泌表达的漆酶活力达到1.108U/mL。     

Expression and purification of goat lactoferrin from Pichia pastoris expression system

ABSTRACT:  The recombinant goat lactoferrin (rGLF) was expressed in the methylotropic yeast Pichia pastoris using pGAPZαC vector, GAP as promoter, and Zeocin as the selective marker. After transformation of the GLF-pGAPZαC into Pichia pastoris X-33 expression host, the GLF-pGAPZαC vector was integrated into the GAP promoter locus of Pichia pastoris X-33 chromosome. The rGLF was expressed and secreted into the broth using α-factor preprosequence. SDS-PAGE and PAS staining analysis indicated that the rGLF could be purified to electrophoretic homogeneity by heparin-Sepharose 6 Fast Flow affinity chromatography and glycosylated by the expression host. The yield of purified rGLF was approximately 2.0 mg/L of culture broth. The N-terminal sequence was identical to the native goat lactoferrin (nGLF). The iron-binding behavior, papain-inhibiting property, and thermal stability of the purified rGLF were comparable to nGLF. This is the 1st report of intact goat lactoferrin expression using the P. pastoris system.     

荧光素酶表达载体构建及其在巴斯德毕赤酵母的表达

萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,FL)是ATP快速检测技术的核心组件,通过荧光强度与ATP浓度的对应关系,在食品行业检测微生物数量发挥着重大作用。本文为实现荧光素酶在重组毕赤酵母GS115中的异源表达,通过从载体pGL2-control中扩增荧光素酶基因luc,克隆到真核表达载体p PIC9K中,线性化后电击转化毕赤酵母GS115菌株,筛选阳性重组菌株。在甲醇的诱导下进行酶的表达,对粗酶液进行生物活性发光分析,然后对粗酶进行超滤、阴离子层析和分子筛凝胶层析三步纯化。甲醇诱导表达96 h发现胞外和胞内粗酶液均有相对较高的酶发光活性,酶活分别为1.45×10~6 RLU/mL和1.58×10~9 RLU/mL。SDS-PAGE与Western blot分析重组荧光蛋白大小约为70 ku,最终纯化得到的荧光素酶,其比活为7.0×10~8 RLU/mg,纯化倍数达到19.3倍,产量为48 mg/L。以上结果表明,荧光素酶能够在毕赤酵母表达系统获得较好的表达和纯化效果。