抗莠去津抗体基因构建及蛋白结构模拟

构建抗莠去津单链抗体基因,采用DNAStar软件对单链抗体基因进行氨基酸序列推导,用生物信息学在线网站预测莠去津单链抗体基本特性及二、三级结构。结果表明,抗莠去津单链抗体基因全长744 bp,对应248 个氨基酸,单链抗体相对分子质量约为26 061.9,等电点预测值7.81,为碱性蛋白质;二级结构中α-螺旋17 处,延伸链85 处,β-转角19 处,无规卷曲127 处;三级结构建模显示,重链和轻链的6 个环区共同组成了抗体的抗原结合区,符合单链抗体的结构特点,具有抗原结合位点的空间构象。该研究为抗莠去津单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究奠定了基础。     

抗呋喃唑酮代谢物单链抗体基因构建及蛋白结构分析和活性鉴定

从单克隆杂交瘤细胞出发,构建抗3-氨基-2-噁唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone,AOZ）衍生物单链抗体基因,并对其蛋白质进行理化性质分析及结构预测和活性鉴定。首先以呋喃唑酮代谢物AOZ衍生物单克隆抗体杂交瘤细胞1D2为原料,提取总RNA后克隆重链（VH）、轻链（VL）可变区基因,然后使用重叠延伸聚合酶链式反应技术用连接肽(G4S)3将VH、VL基因连接构建抗AOZ衍生物单链抗体基因,经测序后采用生物信息软件对抗体编码的氨基酸序列进行推导并展开生物信息学分析,再将此基因与Plip6/GN表达载体连接后进行表达并采用直接竞争酶联免疫分析法（direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay,dcELISA）鉴定其活性。结果表明：抗AOZ衍生物单链抗体基因全长750?bp,编码250?个氨基酸,相对分子质量为27?012.20,理论等电点为9.13,属于碱性氨基酸;其二级结构预测结果显示抗体蛋白含20?处α-螺旋、25?处β-转角、114?处无规卷曲、91?处延伸带结构;三级结构预测的正面俯视图显示重、轻链由连接肽相连形成一个“环桶状”结构,侧面显示为“口袋状”,这与常规单链抗体的结构特征一致,dcELISA结果也显示该抗体具有良好的抗原结合活性。本研究为后续AOZ残留检测免疫分析方法的建立及抗AOZ衍生物单链抗体的改造奠定一定基础。     

抗克伦特罗核糖体展示单链抗体库的构建及鉴定

构建大容量核糖体展示抗克伦特罗单链抗体(single-chain fragment variant,scFv)文库,为进一步筛选抗体奠定基础。用克伦特罗人工抗原免疫小鼠,分离其脾细胞;Trizol法抽提总RNA,反转录成cDNA,PCR及重叠延伸PCR法构建核糖体展示scFv 文库。再通过PCR和重叠延伸PCR在scFv文库序列5＇端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,3＇端添加间隔区序列(T20-V109)、茎环结构构建核糖体展示抗克伦特罗scFv文库。核糖体展示scFv文库与Easy T3载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑取5个阳性克隆双酶切和测序鉴定。结果表明：用于建库材料的免疫小鼠效价为1:128000;成功扩增重链可变区基因大约为360bp和轻链可变区基因大约为330pb;核糖体展示scFv文库基因大约1200bp;库容量达1.75×1013;阳性重组质粒均含有1200bp插入片段;利用IMGT/V-QUEST数据库对单链抗体可变区进行序列分析结果表明,重链可变区和轻链可变区基因均由胚系基因重排得到,且与鼠源胚系基因同源率都达84%以上;氨基酸序列比对结果表明,重链可变区氨基酸序列同源率为37.82%,轻链可变区氨基酸序列同源率为39.09%。其中多样性主要发生在VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。成功构建了大容量抗克伦特罗单链抗体核糖体展示文库。     

抗克伦特罗单链抗体可溶性表达及特性鉴定

目的:表达抗克伦特罗(CBL)可溶性单链抗体(scFv)并进行抗原结合活性鉴定。方法:利用呈现scFv的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2151,IPTG诱导可溶性scFv表达。渗透休克法提取菌体细胞周质腔中scFv。经SDS-PAGE、Western-Blotting以及间接ELISA法分析检测可溶性scFv的表达,并采用间接竞争ELISA法鉴定scFv的抗原结合活性。结果:细菌培养上清及周质腔中均有抗CBL可溶性scFv表达,其分子量约为29kD;上清液及周质腔中scFv效价分别为1:80,1:1600,能够被CBL竞争性抑制,IC50分别为0.78、0.95ng/ml。结论:可溶性抗CBLscFv在大肠杆菌HB2151中获得成功表达,表达的scFv与CBL具有很好的结合活性,可用于进一步建立CBL相应的免疫学检测方法。     

抗呋喃它酮代谢物噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建抗呋喃它酮代谢物(AMOZ)的衍生物噬菌体单链抗体库。方法：从分泌抗AMOZ 的单克隆抗体的杂交瘤细胞系(BC3-E8)中提取总RNA,经RT-PCR 反转录成cDNA,设计通用简并引物,PCR 扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。经重叠延伸PCR (SOE-PCR),将VH 和VL 基因用编码(G1y4Ser)3 的linker随机拼接成单链抗体(scFv)基因,然后将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E 中,转化大肠杆菌(Escherichia coli) TG1 感受态细胞,经辅助噬菌体M13K07 超感染,建立噬菌体单链抗体库。随机挑取10 个阳性克隆,经PCR 和双酶切鉴定,并测序。登陆DNAMAN 软件对序列进行分析、比对。结果：成功扩增VH、VL 及scFv 基因,并得到库容为1.2 × 106 的噬菌体抗体库,噬菌体的滴度为2.0 × 1010PFU,PCR 鉴定及双酶切鉴定文库重组率较高,软件对序列比对结果显示,scFv 基因全长序列之间差异为8.38%,VH 序列差异为3.68%,VL 序列差异为14.34%,且序列差异多集中在CDR 抗原结合区域对应的核酸序列上。结论：已构建抗呋喃它酮代谢物的衍生物噬菌体单链抗体库,为进一步富集筛选并表达抗AMOZ 的衍生物的单链抗体提供参考。     

抗克伦特罗单链抗体在毕赤酵母GS115中的表达

构建表达抗克伦特罗单链抗体(CBL scFv)的毕赤酵母菌株,筛选高拷贝转化子并诱导CBL scFv在毕赤酵母中的分泌表达。将构建的含有CBL scFv基因的重组真核表达载体pPICZαA-CBL经BstX I酶切线性化后,利用电转化方法转化毕赤酵母菌GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性平板筛选高拷贝转化子,以甲醇诱导蛋白表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定及ELISA活性分析。结果显示,通过筛选出的重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为41kDa的蛋白,该蛋白可与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合,且可被游离的CBL竞争性抑制,IC50值为5.1ng/mL。经检测,重组抗体表达量为0.095g/L。这说明分泌表达CBL scFv的毕赤酵母菌株构建成功,为后期CBL scFv发酵与制备奠定了基础。     

原核表达抗克伦特罗重组单链抗体及其纯化研究

目的:原核表达抗克伦特罗重组单链抗体,对表达的包涵体蛋白进行提取和纯化,并鏊定重组抗体特性.方法:通过温度诱导大肠杆菌表达抗克伦特罗单链抗体,超声破碎菌体细胞,采用不同洗涤溶液提取包涵体.以不同变性剂溶解包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化后,经脉冲稀释法将其复性.超滤及透析浓缩蛋白复性液,经Ni-NTA亲和柱二次纯化,得到纯化重组目的蛋白.通过SDS-PAGE电泳分析重组目的蛋白纯度,采用Western bloning和间接竞争EUSA对所制备的抗克伦特罗重组单链抗体特异性进行鉴定.结果:以大肠杆菌Es-cherichia coli BL21(DE3)为宿主菌诱导表达重组单链抗体,产率最高,占菌体蛋白的31%.以1 mol/L尿素洗涤包涵体,6 mol/L盐酸胍为变性剂,经Ni-NTA亲和柱纯化,所得复性重组单链抗体蛋白的纯度达96%.Western blotting分析显示,纯化并复性后的单链抗体可与鼠抗His标签蛋白单克隆抗体发生特异性的结合反应.间接竞争ELSIA结果表明,该重组抗体IC50值为3.35 ng/mL,与沙丁胺醇等结构类似物无交叉反应.结论:原核表达制备的抗克伦特罗重组单链抗体具有较好的抗原结合活性及特异性,为进一步开展克伦特罗的免疫快速检测研究奠定基础.     

抗甲硝唑单链抗体融合蛋白的表达及其ELISA检测方法建立

为实现甲硝唑单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)在大肠杆菌中的可溶性表达,以甲硝唑抗体可变区基因(VH、VL)为模板,扩增甲硝唑的scFv基因,scFv双酶切后与PLIP6/GN载体重组,构建重组质粒PLIP6/GNscFv,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆转大肠杆菌BL21经温度诱导表达重组单链抗体,并通过聚丙酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对其鉴定。采用竞争酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明诱导表达的scFv分子量接近33 kDa,能够特异性识别兽药甲硝唑,半抑制率(IC50)为(0.72±0.04)ng/mL。选择虾样品进行添加回收试验,建立的方法检测其回收率在88.54%到113.27%之间。这说明成功构建重组质粒PLIP6/GN-scFv并实现可溶性表达并可用于实际样品检测。     

氧氟沙星单链抗体库的构建、筛选及蛋白结构模拟

利用噬菌体展示技术构建兽药氧氟沙星单链抗体(scFv)库,从中筛选氧氟沙星特异性噬菌体scFv以及模拟其三维结构。将从氧氟沙星杂交瘤细胞提取的总RNA,用RT-PCR反转录合成第一链cDNA,设计以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的兼并引物,通过PCR扩增获得VH和VL可变区基因,采用重叠延伸PCR技术将VH和VL拼接为全长scFv基因片段,将经内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后的scFv基因片段插入到T7噬菌体中,经包装蛋白体外包装后转化宿主菌BLT5403,成功构建库容量为3×105pfu/mL氧氟沙星单链抗体库,经过4轮吸附-洗脱-扩增的富集后,采用直接竞争ELISA筛选得到4个特异性噬菌体scFv,经测序最后运用Expasy软件模拟特异性scFv的三维结构和物理化学性质。为进一步大量表达氧氟沙星单链抗体奠定了坚实的基础。     

马铃薯α-淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR 方法从马铃薯(Solanum tuberosum)茎段总RNA 中扩增、克隆amyA1 基因(NCBI 登录号GQ406048.1)。采用半定量RT-PCR 方法检测amyA1 基因在马铃薯茎、叶等不同组织中的表达强度,表明在茎组织中的表达丰度略高。利用生物信息学软件分析amyA1 密码子的偏好性;同时对AmyA1 氨基酸的理化性质、细胞内定位、保守结构及高级结构进行预测。基于NCBI 数据库中有物种代表性的29 种α - 淀粉酶基因序列构建了基因进化树。amyA1 基因全长1224bp,可编码一条理论分子质量为46.40kD、407 个氨基酸残基组成的、可能为亲水性的胞外酶。与NCBI已登记的马铃薯α - 淀粉酶基因(登录号M79328.1)核苷酸及氨基酸序列同源性达98%。第20～348 位点范围内的氨基酸残基含有与淀粉酶13 家族及亚家族相似的催化活性域(PF00128、SM00624),第349～407位点范围内的氨基酸残基含有α - 淀粉酶C- 末端β折叠区域(PF07821)。蛋白质结构预测表明氨基酸残基序列有维持淀粉酶活性的(β /α) 8 桶状结构以及其他几个功能域结构。所构建的基因进化树表明,两个马铃薯α - 淀粉酶基因与木薯、苹果的序列同源性较高,与菜豆的次之,与水稻、大麦、玉米等单子叶植物的序列同源性较低。     

贝酵母ADR1基因的克隆和生物信息学分析

酿酒酵母ADR1基因是编码过氧化物酶蛋白质转录的正向调节基因,对乙醇代谢有正向调节作用。本文采用PCR技术首次在贝酵母基因组DNA中对ADR1基因序列进行全长克隆,利用在线分析工具ProtParam、ProtScale、TMHMM、PredictProtein、Swiss-Model等软件对其编码蛋白质的基本理化性质进行分析,同时预测了该基因所编码蛋白质的二级结构和三级结构。结果表明:该核苷酸序列含有一个长3960 bp的开放阅读框,可编码1319个氨基酸。编码的蛋白质为在细胞核中行使调控功能的亲水蛋白,含有17个丝氨酸(S)激酶潜在磷酸化位点、四个coil区和2个锌指结构域,与酿酒酵母ADR1基因所编码的蛋白质结构和性质极为相似,可初步认为贝酵母ADR1基因是乙醇脱氢酶的调控基因。     

葡萄汁酵母NOT5基因生物信息学分析

目的:从转录组分析数据中得到葡萄汁酵母NOT5基因,并对其进行生物学信息分析,为后期研究该基因的作用打下基础。方法:使用在线分析工具COILS Server、SOPMA、Alpha Fold 等分析预测NOT5基因编码蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构及其结构域。结果:葡萄汁酵母NOT5基因核苷酸序列的开放阅读框为1446 bp,可编码481个氨基酸,位于XVI染色体690107~691789,在系统发育树中与真贝酵母（Saccharomyces eubayanus NOT5 like protein XP018219088.1）NOT5基因的亲缘关系最近;其编码的蛋白质是不稳定的亲水蛋白,分子式为C₂₄₉₃H₃₈₄₈N₆₅₄O₇₉₅S₁₉,分子质量为56311.02,不含信号肽,无跨膜区域,存在卷曲螺旋区域,亚细胞定位于细胞质中的线粒体上;蛋白质的二级结构以随机卷曲为主;预测存在Pfam Not3和Pfam NOT2_3_5结构域;以Yeast Not1-Not2-Not5 (4by6.1.C)为模板构建NOT5蛋白的三级结构,两者的序列一致性可以达到89.88%。结论:葡萄汁酵母NOT5基因编码的蛋白结构不稳定,可能在细胞中互连翻译和转录。     

酿酒酵母抗镉基因CAD1的克隆和分析

目的:克隆CAD1基因,对其结构和功能进行预测,为后期研究利用该基因用于重金属镉的解毒作用及其他有毒物质的抗性研究打下基础。方法:使用PCR技术对酿酒酵母BZL06的CAD1基因序列进行全长克隆,再对其进行染色体定位和亲缘关系分析,使用在线分析工具ExPASy、ProtParam等对其编码蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、结构域和蛋白互作进行预测分析。结果:该CAD1基因位于Ⅳ染色体1318046~1319275;全长1230 bp,可编码409个氨基酸,亲缘关系分析表明该基因与酿酒酵母CEN.PK113-7D菌株CAD1基因(GenBank序列号为EIW11633.1)最为接近,同源性达到99%;编码的蛋白质为在细胞核中进行代谢调控的不稳定的亲水蛋白;存在明显的卷曲螺旋区域,不存在跨膜结构,二级结构预测中发现该蛋白主要存在α-螺旋和随机卷曲,β-转角与延伸链分散分布;预测存在bZIP和PAP1结构域;蛋白互作分析中相关系数0.7以上的蛋白有9个,其中相关系数为0.937的SKN7蛋白是CAD1蛋白。结论:分析结果得出克隆CAD1基因正确,其编码的蛋白结构不稳定,在细胞核中代谢,含有与重金属镉与其他有毒物的过表达中存在抗性的表达紧密相关的结构域bZIP和PAP1,在表达抗性时并与SKN7蛋白功能联系密切。     

大米镉结合蛋白的分离及理化特性

本实验选用一种镉含量较高的大米为原料,采用碱法提取大米蛋白（alkali-extractable protein,AP）,依次用热变性和乙醇沉淀分离AP,制备大米镉结合蛋白（rice Cd-binding protein,RCBP）,并分析了RCBP的紫外吸收特征、氨基酸组成、分子质量及二级结构。结果显示：AP、热变性蛋白（thermally denaturated protein,TP）和乙醇沉淀蛋白（ethanol-precipitated protein,EP）均在210 nm波长处有最大吸收峰,氨基酸组成类似;热变性去除了分子质量为94 kD的蛋白质,分子质量为5 094 kD的蛋白质含量减少,乙醇沉淀进一步减少了分子质量分别为50 kD和14 kD的蛋白质。AP的二级结构主要为α-螺旋和β-转角,有少量β-折叠;TP的二级结构只含有β-折叠和β-转角,且以β-折叠为主;EP的二级结构主要为β-折叠和β-转角,还含有少量α-螺旋和无规卷曲。表明热变性和乙醇沉淀使得AP中的镉结合蛋白得到分离,可以作为一种分离RCBP的方法。     

超高压处理对凡纳滨对虾原肌球蛋白构象的影响

以凡纳滨对虾的原肌球蛋白（tropomyosin,TM）为原料,研究不同超高压条件下引发的TM构象变化。采用压力0.1～800 MPa,处理时间10～40 min,温度10～37 ℃处理TM,圆二色光谱法检测其二级结构变化,荧光光度法检测其荧光强度变化,DNA Star Protean软件预测可塑性。结果显示,超高压处理对TM的二级结构无显著影响,不同超高压条件下TM三级结构有显著变化。在实验压力范围内,300 MPa处理的TM疏水性氨基酸暴露程度最小;700 MPa处理后暴露程度最高。经预测,TM的可塑性区域占总氨基酸序列的72.9%。因此,超高压条件下TM的二级结构稳定,三级结构变化较大,三级结构的变化可能与其可塑性区域的比例较高有关。     

产己酸菌Lysinibacillus fusiformis SigA基因的克隆、表达及生物信息学分析

通过克隆产己酸菌Lysinibacillus fusiformis SigA全长基因,并对其进行表达和生物信息学分析。结果表明,SigA基因开放阅读框（ORF）有1 128个碱基,编码327个氨基酸,其分子质量为45.275 kDa;生物信息学预测表明,L. fusiformis与Lysinibacillus sphaericus具有较近的亲缘关系,二者序列相似度达97%;该蛋白为亲水性可溶性蛋白,与Bacillus sp. B14905相似度达100%,其二级结构主要由α-螺旋和loop环状构成,α-螺旋和loop环状分别占其二级结构的60.15%和 37.79%;预测并优化的三级结构由14个α-螺旋和15个loop构成。     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表达及生物信息学分析

采用聚合酶链式反应技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸激酶的全长基因kguK,并在此基础上构建了重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-kguK。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个特异的分子质量约为36.0 ku融合蛋白,且该蛋白的Western-Blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由305个氨基酸残基组成的亲水性蛋白,定位于细胞质中,存在着与pfkB家族蛋白类似的保守结构域,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为35.73%、12.79%和51.48%。