特布他林残留酶联免疫检测方法的建立

采用自主制备的特布他林特异性抗体建立特布他林残留的间接竞争酶联免疫(ELISA)检测方法,对该检测体系的灵敏度、准确度、精密度、特异性进行测定,并将该检测方法与高效液相色谱(HPLC)法进行对比分析。结果表明:特布他林残留检测体系的检测范围为1～100ng/mL,灵敏度为0.47ng/mL,检测限为1ng/mL,回收率80%～99%,与盐酸克伦特罗、硫酸沙丁胺醇的交叉反应率分别为94.9%、93.9%,与盐酸莱克多巴胺及肾上腺素的交叉反应率小于0.01%。采用HPLC法进行沙丁胺醇残留的检测时,其检测范围为10～200μg/mL,检测限为1μg/mL,回收率为79.2%～94.8%。ELISA法与HPLC法相比,灵敏度较高、特异性强、检测结果准确度相近,但在检测结果稳定性方面逊于HPLC法。     

直接竞争酶联免疫分析方法检测猪肉中的沙丁胺醇

建立了一种用于检测沙丁胺醇的直接竞争酶联免疫分析(ELISA)方法,方法灵敏度(IC50)为0.80μg/L,检测限(IC15)为0.06μg/L,检测的线性范围0.06～20.00μg/L。与克伦特罗的交叉反应率为100%,与特布他林的交叉反应率为10.5%,与其他结构类似物并无明显的交叉反应,因此可以采用本实验建立的直接竞争酶联免疫方法同时测定食品中的沙丁胺醇和克伦特罗。本实验的样品处理方法简便,猪肉样品中的检测限为0.6μg/kg,添加三个浓度的样品,其添加回收率均在85%～100%之间,RSD值小于5.51%。      

直接竞争酶联免疫分析方法检测猪肉中的沙丁胺醇

建立了一种用于检测沙丁胺醇的直接竞争酶联免疫分析(ELISA)方法,方法灵敏度(IC50)为0.80μg/L,检测限(IC15)为0.06μg/L,检测的线性范围0.06～20.00μg/L。与克伦特罗的交叉反应率为100%,与特布他林的交叉反应率为10.5%,与其他结构类似物并无明显的交叉反应,因此可以采用本实验建立的直接竞争酶联免疫方法同时测定食品中的沙丁胺醇和克伦特罗。本实验的样品处理方法简便,猪肉样品中的检测限为0.6μg/kg,添加三个浓度的样品,其添加回收率均在85%～100%之间,RSD值小于5.51%。     

沙丁胺醇直接竞争ELISA 法快速测定

建立沙丁胺醇的直接竞争ELISA(dcELISA)快速检测方法,采用高碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记沙丁胺醇单克隆抗体,棋盘滴定法确定包被抗原质量浓度和抗体稀释倍数,通过单因素试验,考察反应体系中表面活性剂、离子浓度、甲醇体积分数、pH 值因素对dcELISA 性能的影响,确定最优检测条件,同时考察方法的特异性。结果表明：酶标抗体克分子比为2.1 时偶合物的滴度最高,最佳反应条件为包被抗原质量浓度1μg/mL,酶标抗体稀释2560 倍,0.01mol/L、pH7.4 的磷酸盐抗体稀释液(PBS)中含体积分数0.05% 的Tween-20、0.5mol/L NaCl溶液和体积分数5% 的甲醇时dcELISA 具有最高的灵敏度和最好的稳定性,所建立方法的IC50 为10.3ng/mL,检测限为0.049ng/mL,线性范围0.3～76.30ng/mL,批内变异系数13.8%,批间变异系数为22.38%,与克伦特罗交叉反应率为321.18%,与溴布特罗交差反应率为29.09%,与其他结构类似物没有明显交叉反应。本研究所建立的dcELISA 可用于沙丁胺醇和克伦特罗的多残留检测。     

盐酸克伦特罗的AlphaLISA检测方法的建立

目的采用纳米均相时间分辨荧光免疫技术(amplified luminescent proximity homogeneous assay,AlphaLISA)建立高灵敏检测盐酸克伦特罗(clenbuterol,CLB)残留的方法。方法在发光微粒上固定CLB,与游离的CLB共同竞争固定在感光微粒上的CLB单克隆抗体,优化检测条件并进行方法学考核。结果该方法的灵敏度为0.04 ng/mL。猪肉样品回收率在83%~109%之间,牛肉样品回收率在92%~112%之间;猪肉样品检测的批内变异系数CV10%、批间变异系数CV15%。与特布他林、沙丁胺醇的交叉反应率分别为34.5%、25.7%,与莱克多巴胺、妥布特罗、齐帕特罗无交叉反应。结论 CLB-AlphaLISA检测肉类中克伦特罗残留具有简单、快速、灵敏性高、特异性强、稳定等特点,具有广阔的应用前景。     

高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中8种β-受体激动剂残留

目的 建立高效液相色谱-串联质谱法(High performance liquid chromatography - tandem mass spectrometery, HPLC-MS/MS)同时测定猪肉中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、非诺特罗、妥布特罗和喷布特罗残留量的方法。方法 2 g猪肉样品加入8 mL 0.2 mol/L乙酸钠水溶液和50 μL β-葡萄糖醛甙酶, 37 ℃水浴处理, 过滤后加入高氯酸除蛋白质, 用氢氧化钠调节pH至9.5~10, 25 mL乙酸乙酯分两次提取, 浓缩, 用正己烷除脂, 采用HPLC-MS/MS多反应监测模式检测, 外标法定量。结果 克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林的线性范围为0.5～5 μg/kg, 氯丙那林、非诺特罗、妥布特罗和喷布特罗的线性范围为0.25～5 μg/kg, 相关系数均大于0.995, 沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、非诺特罗和喷布特罗的检出限为0.25 μg/kg, 定量限为0.50 μg/kg, 克伦特罗、莱克多巴胺、妥布特罗的检出限为0.15 μg/kg, 定量限为0.25 μg/kg。加标回收率为82%～105%, 相对标准偏差为4.65%~16.18%(n=6)。结论 该方法经济、简便、快速、准确, 适用于猪肉中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、非诺特罗、妥布特罗和喷布特罗残留量的检测。     

毒死蜱残留检测间接竞争ELISA 试剂盒的研制

在多克隆抗体的基础上研制一种适用于检测样品中毒死蜱残留的间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒,并对试剂盒的灵敏度、特异性、精密度、准确度和有效期进行测定。结果表明,研制的试剂盒最低检测限为0.5μg/L,线性检测范围为1.8～1000μg/L,供试样品检测结果的批内、批间变异系数均低于8%,回收率均高于85%。试剂盒在4℃或－ 20℃条件下至少可保存6 个月。     

鳗鱼中恩诺沙星残留量的酶联免疫检测方法

运用酶联免疫分析方法测定鳗鱼中恩诺沙星残留。测试曲线线性范围为0.3～10μg/kg,最低检测限为3μg/kg。向样品中分别添加25、50、100μg/kg 3个浓度水平的恩诺沙星, 平均回收率分别为74.5%、76.6%和66.5%,批内变异系数为7.62%～14.31%,批间变异系数为6.03%～7.00%,灵敏度达到0.3μg/kg。特异性试验结果表明与喹诺酮类中的其它药物以及其它类抗生素均无交叉反应。     

三唑磷残留检测直接竞争ELISA试剂盒的研制及应用

采用包被多克隆抗体直接竞争ELISA法研制一种检测水样、蔬菜和粮食样品中三唑磷残留的酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒。将不同浓度的三唑磷添加到水样、蔬菜和粮食样品中,用制备的试剂盒检测三唑磷残留并用气相色谱分析法(GC)进行验证,结果样品的加标回收率在65%～125%之间,变异系数<15%。对试剂盒的灵敏度、特异性、精密度、准确度和有效期进行测定,结果表明:研制的试剂盒最低检测限为4.13ng/mL,线性检测范围3.9～500ng/mL;在4℃或-20℃条件下试剂盒有效期可达6个月。用ELISA试剂盒检测三唑磷残留具有可批量分析样品,快速、简便、灵敏、经济的特点,可广泛应用于环境监测和安全食品的生产。     

胶体金试纸条快速检测食品中磺胺二甲基嘧啶残留

目的：旨在建立一种快速、简便的针对磺胺二甲基嘧啶残留的检测方法。方法：应用竞争抑制免疫层析原理,研制磺胺二甲基嘧啶胶体金试纸条。结果：该试纸条检测限为10ng/mL、检测时间5min,与其他磺胺类药物交叉反应小,可用于多种食品样本的检测,且样本检测限为100μg/kg。结论：该方法操作简便、灵敏度高且特异性强,可实现对食品样品中磺胺二甲基嘧啶残留的快速检测。     

基于不同半抗原的呋喃唑酮代谢物免疫检测方法的建立与比较

为实现呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone,AOZ）的快速定量检测,制备AOZ- 牛血清蛋白单克隆抗体,建立2 种分别基于抗3-（4-羧基苯亚甲基）-氨基-2-恶唑烷酮（CPAOZ）、抗AOZ的单克 隆抗体酶联免疫检测试剂盒。CPAOZ检测试剂盒在1.0～100.0 ng/mL范围具有较好的线性,IC50值为14.6 ng/mL, 检测限为6.56 ng/mL,回收率为97.6%～101.3%;AOZ检测试剂盒在0.5～12.5 ng/mL范围具有良好线性,IC50值为 3.9 ng/mL,检测限为0.45 ng/mL,回收率为94.1%～97.4%。这2 种检测试剂盒对于其他硝基呋喃类抗生素及其代谢 物均不存在交叉反应。从经济、方便、快速、灵敏等因素来考虑,后者更具有发展前景。     

免疫偶联物设计、合成及间接ELISA方法快速检测纯净水中双酚A的研究

设计并合成了双酚A（BPA）的免疫抗原和包被抗原,制备抗BPA多克隆抗体,并建立了间接ELISA方法用于检测瓶装纯净水中BPA的残留。首先,合成了免疫抗原DPA-BSA,并免疫新西兰大白兔得到抗BPA多克隆抗体。其次,合成结构与DPA-OVA有较大差别的包被抗原HPPA-OVA作为\     

高效液相色谱法测定棉籽仁中棉酚的含量

目的：建立棉籽仁中棉酚含量的高效液相色谱测定方法。方法：采用ODS-C18 色谱柱(4.6mm × 200mm,5μm),柱温25℃,流动相为甲醇- 体积分数1% 磷酸溶液(85:15,V/V),流速1.0mL/min,检测波长235nm。结果：棉酚质量浓度在1.9～34.9μg/mL 范围内线性关系良好;棉酚的加标回收率为97.8%～100.3%,RSD值为0.4%～1.2%。结论：此法操作简便、快速、灵敏、准确,样品处理简便易行,适于测定棉籽仁中棉酚的含量。     

Development of monoclonal antibodies and a competitive ELISA detection method for glycinin,an allergen in soybean

Soybean glycinin is a major food allergen causing anaphylaxis. A sensitive detection method for glycinin is needed to evaluate soybean allergies in food and feed products. In the present study, monoclonal antibodies (Mabs) against glycinin were prepared using purified glycinin as the immunogen. The generated Mabs, named 3B2 and 4B2, were identified as being IgG_2b and IgG_2a iso-types respectively, and exhibited high specificity to glycinin. Then we developed a competitive ELISA based on Mab 4B2 to measure glycinin which showed an IC₅₀ value of 1.7 ng/mL with a detection limit of 0.3 ng/mL, and the linear portion of the curve was 0.3–11.2 ng/mL. Recovery tests indicated that the competitive ELISA based on Mab 4B2 gave reliable reproducibility. The produced Mab 4B2 and the developed ELISA could provide a valuable tool for sensitive determination of glycinin and for future studies conducted to reveal the mechanism of how glycinin functions in anaphylaxis.     

赭曲霉毒素A直接竞争ELISA试剂盒的研制

在多克隆抗体的基础上研制了赭曲霉毒素A(OTA)直接竞争酶联免疫检测(cd-ELISA)试剂盒.在0 ～ 10 ng/mL范围内,该试剂盒50％抑制率(IC50)为1.09 ng/mL,检测灵敏度(IC15)为0.08 ng/mL;与赭曲霉毒素B、C的交叉反应率分别为6.28％和0.16％,而与黄曲霉毒素B1等生物毒素未见有交叉反应;板内与板间平均变异系数分别为2.21％和2.79％;花生、玉米和玉米粉3种样品中OTA的检测低限分别为1.71,1.26和1.85 μg/kg,平均添加回收率在83.80％～ 91.40％;与HPLC检测方法具有较高的相关性,相关系数(R2)分别为0.94、0.88和0.90;检测时间只需20 min,可用于花生、玉米及玉米粉中OTA的批量快速筛查.     

乳粉中阪崎肠杆菌污染检测试剂盒的研制

目的：以乳粉中污染的阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）为检测目标,开发一种能快速检测其污染的试剂盒。方法：以两株阪崎肠杆菌单克隆抗体分别为包被抗体和检测抗体,建立双抗体夹心酶联免疫吸附实验方法,优化各个反应条件,制成在2 h内能发生显色反应的检测试剂盒。结果：包被抗体的最佳工作质量浓度为10 μg/mL,检测抗体的最佳稀释倍数为1∶5 000。试剂盒的检测限为104 CFU/mL,在104～108 CFU/mL范围内OD450 nm值与阪崎肠杆菌浓度的常用对数值呈线性关系。特异性实验中,试剂盒可检出3 株阪崎肠杆菌标准菌株,对其他9 株食品中常见致病菌的检测均呈阴性。模拟带菌实验中,初始菌浓度为1 CFU/mL的模拟样品经过8 h前增菌后,通过该试剂盒便可检出。该试剂盒的批内、批间变异系数均小于6%,至少可在室温保存6 个月。结论：该双抗体夹心试剂盒具有灵敏度高、特异性好、精密度高、稳定性强等优点,可应用于乳粉中阪崎肠杆菌的快速检测。     

除草剂异丙甲草胺特异性抗体制备及免疫检测方法的建立

为检测食品中的异丙甲草胺农药残留,降低其对人体可能造成的危害,本文建立了基于抗体的酶联免疫分析方法。首先以除草剂异丙甲草胺、3-巯基丙酸为原料合成半抗原,经由氢核磁共振和质谱方法鉴定后,通过碳二亚胺（EDC）法将半抗原与载体蛋白偶联制备异丙甲草胺人工抗原,免疫新西兰大白兔获取抗体,通过棋盘滴定确定抗原抗体最佳稀释倍数,ELISA反应的抗体稀释液为PBS（1% PEG 6000）,药物稀释液为PBS（10%甲醇）,在此基础上建立间接竞争ELISA标曲,其IC50为14.64 ng/mL,检测限（limit of detection,LOD）为0.8 ng/mL,线性检测范围IC20~IC80为1.51~141.92 ng/mL。与14种结构类似物进行交叉反应,交叉反应率低于3%。向环境水样中添加异丙甲草胺,回收率为86.60%~102.16%,变异系数（RSD）为7.05%~13.30%。此抗体灵敏度高特异性好,可用于食品和环境中异丙甲草胺的监测。     

谷物中伏马菌素B1酶联免疫分析法的建立

以匙孔血蓝蛋白(KLH)为载体,采用碳化亚二胺法人工合成伏马菌素B1(FB1)抗原FB1-KLH,免疫大白兔获得特异性良好的抗FB1 多克隆抗体;在多克隆抗体的基础上建立伏马菌素B1 的间接竞争酶联免疫吸附分析方法,该方法IC50 为11.7μg/L,最低检出限1.1μg/L,平均批内和批间变异系数分别为5.8%、10.2%;分析不同溶剂对标准曲线和加标回收率的影响,确定PBS 溶液为样本最佳提取溶剂;在玉米、小麦、大米、高粱谷物样本中添加50～500μg/kg 的FB1 标准品,平均回收率在70.5%～105.6% 之间。将该方法应用于40 份谷物样本中FB1 的检测,检测结果与高效液相色谱的相关系数(R2)为0.9547。该方法简单、灵敏、快速、准确,适用于谷物中FB1 的检测。     

食品中四环素类残留的酶联免疫检测试剂盒的研制

目的：基于定量检测动物源性食品中四环素类抗生素的残留量,开发研制四环素类抗生素竞争酶联免疫(ELISA)检测试剂盒。方法：采用杂交瘤技术,筛选并克隆稳定分泌抗四环素(CEL)的杂交瘤细胞株,利用免疫BALB/c 小白鼠制备抗四环素单克隆抗体。结果：logit/log 拟合标准曲线为y= － 2.3x ＋ 2.79,相关系数r=0.9971,线性检测范围为0.05～4.05ng/mL,半数抑制剂量(IC50)为0.293ng/mL,灵敏度为0.05ng/mL,检测限为3～5ng/mL;组织、牛奶、蜂蜜的添加回收率分别为(90 ± 10)%、(85 ± 10)%、(90 ± 10)%;平均批内和批间变异系数均小于15%;四环素与金霉素等同类抗生素的交叉反应率大于60%,与其他类抗生素无交叉反应;此试剂盒在4℃可保存180d 以上。结论：建立的试剂盒是符合技术指标的要求,可用于动物源性食品中四环素类抗生素残留的定量检测。