草莓中诺如病毒和甲肝病毒的多重实时荧光逆转录PCR检测方法的建立

目的建立草莓中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒等3种食源性病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法,并应用于实际样品检测。方法对草莓样品进行前处理、病毒富集、病毒RNA提取和纯化后,先采用单重实时荧光RT-PCR进行检测,随后进行多重实时荧光RT-PCR反应条件优化,建立多重实时荧光RT-PCR检测方法并分析其特异性和灵敏度。结果所采用的病毒富集和核酸提取方法可以实现病毒的有效富集和抑制剂的去除,建立的多重实时荧光RT-PCR方法特异性强(100%),对草莓样品中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒的检测灵敏度分别为56.2 RT-PCR50/20 g、31.6 RT-PCR50/20 g和31.4 CCID50/20 g。同时对50份样品进行检测,结果均为阴性。结论所建立的检测方法快速、灵敏、特异性强,适用于草莓产品中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒的同时检测。     

蔬菜及水果中NLVs和HAV检测的研究

目的建立蔬菜水果中诺沃克样病毒(NLVs)和甲肝病毒(HAV)的RT-PCR检测方法。方法使用具有较强缓冲力的甘氨酸缓冲液将病毒从试样表面洗脱下来,用PEG6000将病毒沉降后进行RNA提取和RT-PCR检测。结果蔬菜中NLVs和HAV检测的灵敏度可达1.0×103RT-PCRU50/30 g试样和30 TCID50/30 g试样。而草莓样品的NLVs和HAV最低检出限为1.7×103RT-PCRU50/100 g试样和48 TCID50/100 g试样。结论该方法灵敏、可靠。     

RT-PCR法检测贝类中的甲肝病毒的研究

在世界范围内,甲肝病毒是与食用贝类有关的主要传染性疾病之一。由于贝类中含有PCR抑制剂以及病毒富集过程中病毒的回收率低,阻碍了天然污染的贝类中HAV的PCR检测。研究中建立了一种经苷氨酸缓冲液洗涤,2次PEG沉降富集病毒,然后进行RNA提取和RT-PCR对贝类中的甲肝病毒进行检测的方法。经比较,采用小体系肠道样品检测比采用全贝检测的富集效果更佳,并比较了PEG8000和PEG6000对病毒富集的效果,回收率分别为13.5%和7.6%,此方法可有效地降低PCR抑制剂的影响,最低检测限可达10个TCID50/1.5 g。     

贝类中诺如病毒SYBR Green I实时定量RT-PCR检测方法研究

将诺如病毒(Norovim8es,NV8)RT-PCR特异产物纯化后与pGEM-T裁体连接并转化至感受态细胞DH5α,经测序鏊定.提取阳性克隆质粒DNA,梯度稀释后作为实时荧光定量PCR的标准质粒.使用SYBRGreen I染料建立检测贝类中NV8的实时荧光定量RT-PCR方法.结果表明,本方法标准曲线线性范围可达6个数量级(108～103拷贝),R2为O.9983,比常规RT-PCR方法敏感100倍,且特异性良好,与贝类中的轮状病毒、甲肝病毒均不反应;批内和批间重复性良好,变异系数(CV)分剐在0.28%～4.03%和1.47%～5.53%范围.该方法具有简便、敏感、高效、稳定等优点,可用于水产品中NV8的定量检测.     

数字聚合酶链式反应法检测贝类和浆果中甲肝病毒

目的建立一种数字聚合酶链式反应(PCR)检测贝类和浆果中甲肝病毒的方法。方法样品经蛋白酶K消化-聚乙二醇法进行甲肝病毒富集后,使用高纯度病毒核酸试剂盒进行RNA提取,之后对甲肝病毒进行数字PCR检测。结果本方法对甲肝病毒有典型扩增,重复性和稳定性良好,对于草莓样品中甲肝病毒的检测灵敏度为25.30 CCID_(50)/20 g,树莓样品中甲肝病毒的检测灵敏度为6.32 CCID_(50)/20 g,贝类样品中甲肝病毒的检测灵敏度为12.54 CCID_(50)/2 g,表明其灵敏度高。结论该方法快速、准确、灵敏,适合测定贝类和浆果食品中甲肝病毒。     

贝类中甲肝病毒提取方法的比较

目的对贝类甲肝病毒的3种试剂盒提取方法进行比较。方法在贝类样品中添加不同滴度的甲肝减毒疫苗后,采用3种核酸提取法:Roche法、AM1836法、Qiagen74104法。按照其说明书提取模拟样品病毒核酸模板,从抽提效率、抽提核酸的稳定性、抑制剂去除效率3个方面对提取效果进行比较。结果在抽提核酸稳定性、抑制剂去除效率方面,3种方法结果相同,稳定性的Ct值为24.795～28.651,抑制剂去除效率方面提取的核酸10倍稀释核酸Ct值比未稀释核酸Ct值差值均为2.9～3.2左右(F=26.802,P0.05);在提取效率方面,Roche法高于AM1836法和Qiagen74104法,Ct值分别为28.5,28.7和29.0。结论 3种方法中,Roche法在贝类中甲肝病毒提取方面更有优势,可以提高贝类中甲肝病毒检测的灵敏度。     

电化学安培技术检测还原糖方法的建立

建立了电化学安培技术检测还原糖含量的新方法,与已知方法相比降低了反应温度,使反应更易控制;缩短反应时间,提高了还原糖的分析速度。该方法在还原糖浓度0～20.0 mg/20mL范围内有良好的线性关系,线性相关系数r=0.9999;最低检出限为2.00μg/mL,灵敏度较高;对同一份标准液连续测定(n=9)的相对标准偏差为0.841%,说明精密度良好。分别检测了橙汁、发酵液、糖化液3种样品,回收率在99.6%～102.0%,表明此方法抗干扰性能良好,能满足测定不同类型样品的需要。     

检测诺如病毒的罗氏LightMix Kit方法与行业标准方法(SN/T 2626—2010)的比较研究

目的结合不同标准和规范方法,对罗氏LightMix~Kit诺如病毒检测试剂盒(以下简称罗氏方法)进行评价。方法通过对217份门诊腹泻病人粪便标本和158份市场零售贝类样品中诺如病毒核酸平行检测,对比罗氏方法与我国SN/T 2626—2010《国境口岸诺如病毒检测方法》中逆转录-聚合酶链反应检测诺如病毒核酸方法(以下简称SN/T方法)对粪便标本与贝类样品中诺如病毒核酸检测结果的差异。结果粪便标本的罗氏方法检测阳性率为27.2%(59/217),而SN/T方法检测阳性率为17.5%(38/217),两方法结果一致率为85.7%,检出率差异有统计学意义(P0.05)。贝类样品的罗氏方法检测阳性率为32.9%(52/158),SN/T方法检测阳性率为30.4%(48/158),两方法对诺如病毒检测结果的一致率为87.3%,检出率差异无统计学意义(P0.05)。结论市场零售贝类样品中诺如病毒污染率较高,罗氏方法以其快速、简便、灵敏、可靠的优点值得在食品微生物检测行业推广。     

Taqman-MGB探针RT-PCR方法检测食品中脊髓灰质炎病毒

目的：建立食品中脊髓灰质炎病毒Taqman-MGB 探针实时荧光RT-PCR 检测方法。方法：在脊髓灰质炎病毒基因组2A 区设计引物和探针,对3 种血清型脊髓灰质炎病毒进行单独和同时检测。通过参照分子建立标准曲线,对人工接种病毒的牡蛎、蓝莓、生菜和水食品样品进行检测。结果：建立的检测体系分别高度特异于相应血清型病毒检测,对3 种血清型脊髓灰质炎病毒进行单独和同时检测的下限均为2 拷贝参照分子DNA。基于参照分子建立的4 条标准曲线具有很好线性关系(R2 ＝ 0.999)和较高反应效率(1.01～1.04)。对4 种食品样品的分析表明,建立的实时荧光RT-PCR 方法可稳定检测到各添加浓度脊髓灰质炎病毒。结论：建立的Taqman-MGB 探针实时荧光RT-PCR 检测体系适于食品中脊髓灰质炎病毒的检测。     

多重烟草病毒胶体金检测试纸条的研制及应用

为建立一种快速、特异、简便的多重烟草病毒检测方法,用胶体金标记和免疫层析技术研制了双重(TMV-CMV、CMV-PVY、TMV-PVY)和三重(TMV-CMV-PVY)病毒试纸条。测试结果表明,三重病毒检测试纸条对目标病毒(TMV、CMV和PVY)的检测具有良好的灵敏性和特异性。检出TMV、CMV和PVY的最低浓度分别在1.02～10.2、1.10～11.0、1.20～12.0 ng/mL之间。对烟草危害严重的TEV、PVA和TSWV均无交叉反应。用三重病毒检测试纸条对苗棚中的烟株进行检测,其结果与RT-PCR检测结果的符合率≥90%。     

三种鱼类链球菌三重实时荧光PCR方法的建立

对3种链球菌基因序列的分析,设计了3条Taq Man探针,并选择3种无相互干扰的荧光基团进行标记。建立了三重实时荧光PCR的检测方法,同时对建立的方法进行了特异性、灵敏度、稳定性和重复性评价,并且与传统培养法进行了比较。结果显示,试验建立的方法能特异扩增出3种链球菌的标准阳性菌株;3种链球菌之间没有交叉反应;S.agalactiae的检测灵敏度约为1.52×10~1 CFU/mL;S.dysgalactiae的检测灵敏度约为1.33×10~2 CFU/mL;S.milleri的检测灵敏度约为1.76×10~1 CFU/mL;3种链球菌检测反应的CV值均小于5%;对采集的287份样品进行检测,共计检出5份S.agalactiae阳性样品、3份S.dysgalactiae阳性样品和1份S.milleri阳性样品与传统细菌分离鉴定的方法检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

ELISA法与LC-MS/MS法测定动物组织中克仑特罗残留

目的:比较酶联免疫法(ELISA)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定动物组织中克仑特罗残留量的准确度、精密度及检测限。方法:样品经过处理后,分别采用ELISA法和LC-MS/MS法进行测定;用ELISA法对组织样品进行初筛,测出阳性样品利用LC-MS/MS法进行确证。结果:应用ELISA法测定样品猪肉样品中克仑特罗的回收率为67.0%～99.6%,批内变异系数3.4%～8.7%,批间变异系数6.1%～9.6%,灵敏度为0.025μg/L,最低检测限0.025μg/kg;LC-MS/MS检测方法回收率88.62%～111.43%,批内变异系数4.4%～7.4%,最低检测限0.5μg/kg;用ELISA法对50份猪肉和50份猪肝样品进行检测,筛选出3个阳性样品,经LC-MS/MS确证为阳性,两种方法检测结果一致。结论:ELISA法灵敏度和准确度较高,样品处理方法简单,成本低,适合组织中克仑特罗残留大规模筛查;LC-MS/MS准确度高,适合于阳性样品精确定量。     

利用便携式血糖仪测定酱油中的葡萄糖

目的:建立一种方便、快速检测酱油中葡萄糖的方法。方法:用便携式血糖仪检测市售酱油中的葡萄糖,并进行重复性试验、回收试验、线性试验。结果:5种不同品牌酱油的葡萄糖浓度分别是25.38、8.28、31.86、8.82、12.06g/L,标准差SD为0.129,批内CV为2.9%,回收率99.9%～101%,平均回收率100.4%,线性方程为y=4.2608x+2.5929,相关系数R2=0.9991,在0.5～5g/L范围内线性关系良好。结论:便携式血糖仪能检测酱油中葡萄糖含量,为检测酱油中的葡萄糖提供了一种便捷的方法。     

国标法和新型试剂盒法测定乳粉中生物素含量

国标法和新型试剂盒法利用植物乳杆菌对生物素的高度特异性和敏感性,定量测出乳粉样品中生物素的含量。通过对标准乳粉质控样品的检测,测得国标法标准曲线在0.00～1.00 ng范围内线性关系良好(R~2=0.999 0),方法检出限为2.0μg/100 g,所测样品RSD为3.22%(n=6);测得试剂盒法标准曲线在0.00～0.52μg/100 g范围内线性关系良好(R~2=0.992 3),方法检出限为0.02μg/100 g,所测样品RSD为3.18%(n=6);两种方法生物素测定值均在给定值范围内,且差异不显著(p0.05)。在50%, 100%和200%添加水平下,生物素回收率均在90%～110%之间(RSD10%),样品重复性试验结果RSD小于5%。两种方法对标准质控样检测结果稳定准确、重复性好,适用于乳粉中生物素含量的检测。     

QuEChERS-UPLC-MS/MS测定焙烤食品中4种链格孢菌毒素

建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定焙烤食品中4种链格孢菌毒素(腾毒素、链格孢菌酚、交链胞酚单甲醚、细交链胞菌酮酸)快速检测方法。样品经乙腈-0.1 mol/L盐酸溶液超声萃取,萃取液经QuEChERS净化处理,在RP18色谱柱(2.1 mm×100mm,1.7μm)上以乙腈和1 mmol/L碳酸氢铵为流动相梯度洗脱,采用电喷雾离子源、正负离子多反应监测模式检测,外标法定量。结果表明,4种待测物在相应的浓度范围内线性良好,相关系数均大于0.999;方法定量限(S/N≥10)为0.03～0.3μg/kg;进行3个水平的添加回收实验,平均回收率(n=6)为83.2%～105.3%;相对标准偏差(RSD,n=6)为1.2%～6.4%。应用本方法检测45个焙烤食品样品,4种真菌毒素均有检出。其中24份样品检出AME,含量为0.1～4.6μg/kg;6份样品检出AOH,含量为0.47～1.5μg/kg;27份样品检出Te A,含量为0.6～3.7μg/kg;9份样品检出TEN,含量为0.3～2.1μg/kg。     

流动注射在线稀释法测定制革用水和废水中钙离子

建立了流动注射分析皮革废水中钙离子的方法。在 pH 值 2. 5 条件下,CPAⅢ与钙离子反应生成蓝色稳定络合物( 波长 605nm) 。通过在线稀释样品,实现样品的实时在线分析。方法的线性范围为 0. 1 ～ 50mg/L,相对标准偏差为1. 04% ( n = 10) ,样品加标回收率在 97. 0% ～ 98. 2% 之间,具有良好的重现性和准确性。此方法适合制革用水和制革废水中钙离子的检测。     

生牛乳中乳铁蛋白的蛋白质芯片检测平台的评价研究

目的对本研究前期建立的用于乳铁蛋白的蛋白质芯片检测平台进行评价。方法使用3份生牛乳样品,批内重复8次检测,计算批内精密度;另对3份生牛乳分别重复8个批次检测,计算批间精密度。对高浓度标准品稀释3个浓度后,进行稀释回收率试验;另对3个浓度基础液分别进行加标回收率试验;取10份生牛乳样品,分别用蛋白质芯片检测平台与商用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒进行检测并对结果进行方法学比较。结果用于生牛乳中乳铁蛋白的蛋白质芯片检测平台的批内精密度在9.79%~15.90%之间,批间精密度在11.63%~23.38%之间;稀释回收率在79.8%~129.7%之间,加标回收率在105.7%~133.9%之间;经比较,两种方法的相关系数r=0.825 2,差异有统计学意义(t=4.132,P0.05),配对比较t检验结果显示两种方法差异无统计学意义(t=1.282,P0.05)。结论本研究建立的用于乳铁蛋白的蛋白质芯片检测平台能够满足实验室检测需要,尚有操作偏倚需进一步优化。     

液相色谱串联质谱法同时测定凡纳滨对虾中的27种抗寄生虫药物残留

目的:规范凡纳滨对虾抗寄生虫药物的使用。方法:用80%乙腈水溶液提取凡纳滨对虾样品中的抗寄生虫药物，经C₁₈和中性氧化铝粉净化后，超高效液相色谱—串联质谱分析。药物经Thermo Hypersil Gold aQ色谱柱分离，0.1%甲酸—乙腈和10 mmol/L甲酸铵溶液(含0.1%甲酸)分别作为有机相和水相进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源正负离子同步扫描，多反应监测模式，基质匹配标准溶液外标法定量分析。结果:27种抗寄生虫药物在一定浓度范围内皮尔森相关系数(r)大于0.974 1,线性关系良好；检出限为0.5～2.0μg/kg,定量限为2～5μg/kg;空白样品在5,10,50μg/kg 3个添加水平下的方法加标回收率(n=6)为61.90%～118.54%,批内变异系数(n=6)为0.57%～12.56%,批间变异系数(n=3)为1.29%～16.47%。结论:该方法选择性好，回收率、精密度高，测定周期短，可满足实验室的检测需要。     

新型维生素检测试剂盒测定奶粉中叶酸的含量

考察新型维生素检测试剂盒在奶粉中叶酸含量测定方面的检测效果。按照试剂盒说明书测定奶粉中叶酸的含量,同时与国家标准GB 5413.16-2010和进口某品牌试剂盒对比;并进行回收率、批内和批间差异验证。结果表明:检测4种奶粉样品和1份标准质控样品,3种检测方法样品测定结果CV值小于10%,新型维生素检测试剂盒标准质控样品测定值与参考值的相对误差为4.0%,回收率为90%~110%(RSD10%),批内差异为3.49%~4.86%,批间差异为4.25%~6.56%。新型维生素检测试剂盒具有较好的准确度、精密度和稳定性,相对传统微生物方法操作简单、结果准确、重复性好,适用于奶粉中叶酸含量的检测。