免疫磁珠捕获-通用引物PCR快速检测食品中致病菌的研究

为了提高食品中致病菌的检出率和灵敏度,利用免疫磁珠捕获结合经典PCR技术建立免疫捕捉通用引物PCR(IMC-UPPCR)检测食品中的致病菌.结果显示,采用细菌16SrRNA基因保守区设计特异性引物,建立通用引物PCR技术是可行的,IC-UPPCR检测致病菌的最低检测限可达10 cfu,检测致病菌的特异性为100%,无假阳性和假阴性出现.采用本方法与国标方法分别对50种不同样品进行3种致病菌检测,结果显示两种方法的符合率达100%,特异性相当.与国标方法相比,本方法灵敏度更高,并具有简单、快速、特异性好和敏感性高等特点,可以满足大批样品致病菌筛选检测的要求,适用于食品卫生监管、商品检验检疫等领域.     

通用引物多重PCR技术检测3种病原微生物

为寻找快速且准确的病原微生物检测方法,在普通多重PCR(polymerase chain reaction)技术的基础上研究一种新的通用引物多重PCR(universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR)技术。利用该技术对食品中主要的3种致病菌——大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌进行同时检测,经过单重PCR验证、二重以及三重UP-PCR反应条件和体系优化。结果表明,该方法的最低检测限为0.5pg目标DNA,复合引物和通用引物的加入量分别为2nmol/L和300nmol/L。此方法检测灵敏度高、病原菌检测限低,可在实践中应用。     

免疫磁捕获-荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌

建立了免疫磁珠分离（Immunomagnetic separation,IMS）联合荧光定量PCR（Real-time PCR）技术准确、快速检测食品中沙门氏菌（Salmonella spp）的方法。采用亲和纯化的羊抗沙门氏菌抗体与Dynabeads M-280磁珠制备沙门氏菌免疫磁珠,优化反应条件,建立免疫磁珠分离方法。同时根据沙门氏菌特异性ttr基因,建立Real-time PCR体系,并检测其特异性及敏感性。结果显示,沙门氏菌可产生荧光信号,而其他细菌均未见明显荧光信号。利用所建立的免疫磁捕获-荧光定量PCR（IMS-real-time PCR）方法可以检测初始含菌量最低为6.5CFU/25g的食品样品,全过程需时约8h。150份实际食品样品中,IMS-real-time PCR方法检出27份阳性样品,免疫磁珠联合XLT4平板培养法检出18份阳性样品,传统国标法检出14份阳性样品。      

实时荧光PCR法检测食品中亚利桑那沙门氏菌

沙门氏菌（Salmonella）是食品检测过程中最常见的致病菌之一,亚利桑那沙门氏菌（Salmonella arizonae）又是沙门氏菌中比 较难鉴定的亚种。该实验通过实时荧光聚合酶链式反应（PCR）方法快速准确的检测亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌。根据GenBank 公布的亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌gud D基因序列, 分别设计引物和Taqman探针。 使用10株不同血清型的沙门氏菌标准菌 株、88株沙门氏菌分离株和29株食品中常见食源性致病菌进行实时荧光PCR特异性实验。结果显示,该实验所设计的引物探针特异 性非常好。 实时荧光PCR灵敏性试验结果表明,检测灵敏度可达到1～10 CFU/mL的添加浓度。 经模拟污染样品验证,所建立的实时 荧光PCR方法与传统方法的检测结果相一致,具有检测周期短、操作简便的优势。     

基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中肠道沙门氏菌和肠炎沙门氏菌

建立基于TaqMan探针双重重实时荧光PCR检测肠道沙门氏菌(Salmonella enterica,SP)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis,SE)的方法。根据SP的aceA基因(Gen Bank:U43344.1)、肠炎沙门氏菌特异序列SEP(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,在ace A探针的5′端标记FAM和SEP探针的5′端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。试验结果,58株29种不同血清型肠道沙门氏菌均扩增出ace A基因扩增曲线,SEP特异性地扩增出15株SE,而28种不同血清型沙门氏菌和17株变形杆菌等阴性对照株扩增结果均为阴性。ace A和SEP的双重荧光PCR扩增效率分别为100%和104%,R2分别为0.999和0.998,最低检测浓度分别达到280 cfu/m L和260 cfu/m L。建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31 h完成,是快速检测SP和SE的有效方法,可用于食品中SP和SE的特异性检测。     

通用引物多重PCR新技术对番木瓜转基因成分检测的研究

为了满足能够同时对多个靶标进行检测,克服传统多重PCR的引物间排斥、重现性差等缺点的要求,建立通用引物多重PCR新方法对番木瓜中转基因成分进行高效、快速的检测。选用三种转基因番木瓜(Event 55-1、"GM-YK"和"华农一号")和非转基因番木瓜("台农2号")的新鲜叶片为研究对象,根据三种转基因番木瓜的外源基因和内标木瓜蛋白酶基因(papain)序列,设计五种特异性引物。通过比较不加入接头的特异性引物的PCR验证结果,发现复合引物(带通用接头的引物)无论在单重PCR或者多重PCR的检测中的电泳条带均更为明亮清晰。而由灵敏度的对比,可以得出通用引物多重PCR灵敏度比普通引物的灵敏度提高了1个数量级。通用引物多重PCR新技术较普通多重PCR方法检测番木瓜中转基因成分拥有更低的检测限和灵敏度,为转基因成分的快速检测提供一种新技术。     

实时荧光PCR检测食品中丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌

建立实时荧光PCR检测丙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi C/Salmonella paratyphi C)和猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis/Salmonella Choleraesuis)的方法。根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌序列,分别设计引物和Taqman探针,使用168株不同血清型的沙门氏菌和21株变形杆菌等非沙门氏菌进行实时荧光PCR检测的特异性试验,可以实现特异性检测丙型副伤寒沙门氏菌,并且可以同时检测丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌。经模拟污染样品检测,灵敏度可达到2～5 cfu/mL的添加浓度。该方法可以快速检测食品中丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌。     

应用通用引物PCR法检测葡萄球菌A、D和E型肠毒素基因

本实验采用20bp通用引物P3和P4的PCR方法对产A、D和E肠毒素的葡萄球菌进行了检测。结果表明,产SEE菌株能产生666bp的特异扩增片段,产SEA菌株产生666bp和约400bp两条扩增带,产SED菌株产生400bp片段;SEE菌株的扩增产物经EcoRV酶切能产生251和415bp两个片段。扩增敏感性实验表明,该方法可检出10~6个细菌。     

PCR技术在食品沙门氏菌检测中的应用

介绍了PCR技术的原理及其在食品沙门氏菌检测中的应用,同时提出了尚存在的问题,并对其应用前景作了展望。     

一种检测肉品的新型通用单引物多重PCR技术

在市场中,牛、羊肉中掺杂价格便宜的猪肉,以次充好的欺骗行为屡见不鲜,而且近些年来出现疯牛病、禽流感等疾病,肉品的种属鉴定变得至关重要。随着分子生物学的深入研究,多重PCR技术得到了飞快的发展,但是其扩增效率和检测限达不到理想要求。为寻找快速、灵敏、特异的检测生肉品种的方法,在普通多重PCR的基础上发展了一种新的通用单引物多重PCR（CSP-M-PCR）技术,该方法的体系中,所有目的片段共用一样的上游引物进行扩增,检测限可达5μmol/L。此方法不仅弥补了普通多重PCR扩增效率较低、检测限不理想的缺点,还提高了检测的灵敏度、降低了检测的成本。     

实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌

目的 建立实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。方法 基于鼠伤寒沙门氏菌II型限制酶基因, 设计引物及Taqman探针, 利用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果 特异性探针可从25种血清型沙门氏菌(共49株)及11株阴性对照菌株中检测出全部的11株鼠伤寒沙门氏菌。以鼠伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验, 菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系, 线性系数(R2)为0.998, 扩增效率90%, 最低检测浓度300 cfu/mL。对已接种鼠伤寒沙门氏菌的4种模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定, 两者结果一致。结论 此方法特异、灵敏、准确, 适于食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。     

食品中金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的研究

以耐热核酸酶基因nuc、纤维蛋白原结合蛋白基因clfA和SmaI限制性酶切片段特异序列为靶基因,设计筛选引物,建立并优化了检测金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus,SA)的多重PCR体系。采用10株SA和46株非SA验证了该多重PCR具有很好的特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到1.197 3 ng。人工污染样品,当起始污染量为1.2个/g时,37℃增菌培养6 h即可检出。一共检测了43份样品,检出3份阳性样品,其中有2份阳性样品与传统方法一致,另外一份阳性样品用测序验证。作者建立的多重PCR方法可特异、快速地实现对SA的检测。     

宠物食品中沙门氏菌辐照模型的建立

为了建立宠物食品中沙门氏菌的辐照模型,研究了用60Coγ射线辐照不同理化性质的宠物食品,考核理化性质对沙门氏菌灭菌效果的影响.考察了初始菌数量、pH值、含水量、蛋白质含量、辐照后储存时间等因素对沙门氏菌杀灭效果的影响,得到了宠物食品中沙门氏菌的辐照模型.模型的建立为宠物食品中沙门氏菌的灭菌提供了新的方法,为其他类型菌株的辐照灭菌提供参考,在生产上具有一定的指导意义.     

应用PCR检测食品中沙门氏菌前的增菌程序的优化

为了探讨更为简便、快速的增菌程序,对4 株食品中来源沙门氏菌进行增菌,比较振荡培养与静止培养,MM 增菌液和 BPW 增菌液,以及以BPW 为增菌液培养6、8、24h 的增菌效果。结果显示对于4 株食品中来源的沙门氏菌增菌6h 和8h 后,振荡培养相对于静止培养并不能够提高沙门氏菌的增菌效果(p ＞ 0.05),但增菌24h 后振荡培养能够极显著的提高增菌效果(p ＜ 0.01);在增菌6h 和8h 后,使用MM增菌液相对于BPW增菌液并不能提高增菌效果(p ＞ 0.05),但增菌24h 后,使用MM增菌液能够极显著的提高增菌效果(p ＜ 0.01);与使用BPW增菌液增菌8h 比增菌6h 的增菌效果达到极显著效应(p ＜ 0.01),增菌24h 与增菌8h 相比,增菌效果极显著(p ＜ 0.01)。结果表明：应用PCR 检测食品中的沙门氏菌前对于沙门氏菌增菌的前8h,使用振荡培养和选择性培养液MM培养液增菌并不能提高增菌效果;使用BPW 增菌液增菌8h 与增菌6h 相比增菌效果显著。由此可见在对食品中的沙门氏菌增菌时使用BPW 液37℃静止培养增菌8h,是一种优化的增菌程序。     

沙门氏菌多重PCR检测方法的建立

采用CTAB/NaCl法提取沙门氏菌及对照菌株的基因组DNA。对引物浓度、TaqDNA聚合酶用量进行优化,建立了沙门氏菌属特异基因-hut基因(495bp)、hilA基因(490bp)、invA基因(284bp)和hns基因(152bp)间的多重PCR检测方法,并进行了灵敏度测试。结果表明,建立的多重PCR检测结果与预期一致,二重PCR的检测灵敏度与单一PCR的一致,三重PCR检测灵敏度有所下降。     

食品中沙门菌PCR检测方法的建立

为建立食品中快速检测沙门菌的PCR方法。选取沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA基因上的靶序列设计一对引物,选择最适Mg 浓度和退火温度,建立最适PCR反应体系,用2%琼脂糖,5μl反应产物(包括EB),100V,40min进行电泳,显像。用该引物对已经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌进行特异性检测,并对人工污染的食品进行检测条件的研究。Mg 浓度和退火温度对该反应体系的影响较小,稳定性较好;经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌验证了该检验方法具有很好的特异性;该检测方法可以在19h内检出含有沙门菌102CFUg的食品(火腿肠、鸡蛋、散装肉馅)。与传统方法比较,该方法快速、敏感、特异,能在较短的时间内对大量样品同时进行检测,适用于食品中沙门菌的快速、敏感、特异检测。     

PCR 方法检测河豚鱼的引物筛选及反应体系优化

根据Genbank 公布的河豚鱼细胞色素b 基因序列,应用软件Primer Premier 5.00 版设计了7 对引物,经过PCR 筛选,确定可以在所有8 个供试河豚鱼样品中检出目的DNA 片段的引物HT-1,用于建立河豚鱼的PCR 检测方法。对该PCR 方法中6 个因素包括退火温度、Mg2+ 终浓度、Taq DNA 聚合酶用量、dNTPs 终浓度、引物终浓度和模板DNA 用量进行优化,确定优化的PCR 扩增体系：10 × PCR 缓冲液2μL,MgCl2 终浓度1.5mmol/L,Taq DNA 聚合酶1.0U,dNTPs 终浓度300μmol/L,引物终浓度0.2μmol/L,DNA 模板400ng,加纯水至总体积20μL。扩增程序定为94℃预变性5min,94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸30s,40 个循环,72℃延伸5min。据此建立河豚鱼成分PCR 检测方法,并通过河豚鱼与非河豚鱼的PCR 检测结果比较,验证了该方法的河豚鱼特异性。研究结果还表明,该方法的检出限为0.1%,含量为0.1% 的河豚鱼样品PCR 检出率至少在97.5% 以上。     

转基因植物食品的检测策略

近年来 ,随着越来越多的转基因植物被批准商业化生产 ,由此衍生而来的转基因食品数量也迅速增加 ,引起了社会各界对转基因食品的广泛关注。为了消除消费者对转基因食品安全性的疑虑 ,保证转基因植物的健康发展 ,包括我国政府在内的世界上许多国家针对转基因食品的研究开发制定了严格的管理条例 ,转基因食品的标识制度是其中重要的一条。建立准确可靠的转基因食品鉴别技术是贯彻转基因食品标识制度的基础。本文在对转基因食品与传统食品的差异进行详细分析的基础上 ,讨论了鉴别转基因食品的一般策略 ,并对利用PCR技术鉴别转基因食品的基本原理及技术要点作了简要介绍