单核细胞增多性李斯特菌p60蛋白表达条件的优化

在成功构建重组表达载体pET-28a-p60 和获得重组宿主菌E.coli BL21(DE3)的基础上,对重组宿主菌E.coliBL21(DE3)进行表达p60 蛋白条件的优化研究。结果表明：将重组大肠杆菌培养至OD600nm 达0.7～0.8 左右时,加入浓度为1mmol/L 的异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),在摇床温度为25℃,转速为150r/min 条件下诱导表达6h,可得到重组表达的p60 蛋白占总蛋白的比例为42.32%,其中可溶性蛋白占总p60 蛋白的比例为85.36% 左右,为p60 蛋白诱导表达的最优条件。     

单核细胞增生李斯特菌ladR基因在两种原核表达载体中的克隆表达及纯化分析

利用特异性引物扩增ladR基因序列,分别构建单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ladR基因的两种原核表达载体,即含有6个His标签的pET-28a-ladR表达载体和含有GST标签的pGEX-4T-ladR表达载体。通过诱导时间、温度和浓度优化两种表达载体的蛋白表达条件,比较分析两种表达载体的LadR蛋白可溶性表达水平,利用Western-Blot进行LadR蛋白表达验证。本研究成功构建了pET-28a-ladR和pGEX-4T-ladR表达载体,在大肠杆菌BL21中分别表达出His-LadR和GST-LadR融合蛋白。通过凝血酶切除GST标签,纯化后得到LadR蛋白。在最佳表达条件IPTG为0.5 mmol/L,22 ℃诱导过夜下,pGEX-4T-ladR表达载体中LadR的表达量比pET-28a-ladR（IPTG为1.0 mmol/L,22 ℃诱导过夜）中His-LadR蛋白的表达量高4.48倍。本研究结果表明,GST标签有利于ladR基因的可溶性表达,为后续的LadR蛋白的功能分析和转录调控机理研究奠定了良好基础。     

蜡样芽孢杆菌LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆和生物信息学分析

为研究蜡样芽孢杆菌LJ01(Bacillus cereus LJ01)中亚硝酸盐还原酶(NiR)的酶学性质,获得高表达量的基因工程菌,本文对B.cereus LJ01的NiR序列进行了生物信息学分析,并将NiR基因克隆到表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21,随后探究了不同诱导条件对重组NiR表达量的影响。结果表明NiR编码蛋白的理论分子量约为60 kDa,理论pI为5.47,二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,是不具有跨膜结构的亲水性蛋白。随着诱导温度的升高,重组NiR的表达量逐渐减少,诱导温度为16℃时重组NiR表达量最高。在同一诱导温度下,NiR在pET-28a(+)-nir-BL21中的表达量明显高于pET-32a(+)-nir-BL21,因此选用pET-28a(+)-nir-BL21作为基因工程菌。从B.cereus LJ01中克隆了NiR基因,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21,为该重组NiR的理化性质研究和食源芽孢杆菌中NiR的异源表达奠定了基础。     

水稻密码子优化的cry2A^＊基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化

通过PCR从克隆载体puC18-3Z/Cry2A*上扩增水稻偏爱型密码子优化的抗虫基因cry2A*,经限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切定向插入到原核表达载体pET-28a( ),成功构建了在表达蛋白的N端只带有6个组氨酸标签的融合蛋白表达载体pET-28a( )/Cry2A*,并转入人肠杆菌BL21(DE3)中.通过对其表达条件进行优化,发现在IPTG浓度为0.05mmol/L、诱导时问为3h、诱导温度为20℃的表达条件下目的蛋白大部分以可溶形式进行表达.采用Ni-NTA亲和柱纯化得到高纯度目的蛋白,薄层扫描分析蛋白纯度达到95%.     

食源性单增李斯特氏菌Lm319的毒力基因在四种肉汤培养基中表达分析

为了探明食源性单增李斯特菌的毒力基因在四种不同天然肉汤中的表达情况,了解食源性单增李斯特菌在不同肉类食品中的毒力水平。对单增李斯特菌Lm319中27个毒力基因进行PCR检测,并对Lm319在猪、鸡、牛和羊四种肉汤培养条件下27个毒力基因的表达情况进行RT-PCR检测。结果显示:单增李斯特菌Lm319中含有23个毒力基因;猪肉汤培养基中能表达的毒力基因种类以及基因表达量都是最高的,其次是羊肉肉汤培养基和牛肉肉汤培养基,而鸡肉肉汤培养基中表达的基因最少;同时发现iap、fbp、hpt和bsh这4个毒力基因的表达与prf A基因存在相关性。本研究表明,单增李斯特菌在不同生长环境下其毒力基因表达存在较大差异。     

食源性单核增生性李斯特氏菌毒力基因的分布

为探明保定、石家庄及周边地区食源性单增李斯特菌的污染状况以及食源性单增李斯特菌中毒力基因的分布情况,从保定、石家庄及周边地区农贸市场、超市采集七大类食品,共1 288个样品进行单增李斯特菌的污染调查,对鉴定分离出的308株食源性单增李斯特菌的27个毒力基因进行PCR检测。结果表明:七大类食品中单增李斯特菌的平均检出率为23.91%,动物源食品单增李斯特菌污染远高于植物源食品;27个毒力基因的PCR检测发现,inl、plcA、plcB、hpt、hly及fbp等与侵入、感染有关的毒力基因在动物源食品分离株中分布明显高于植物源食品分离株;而iap、ami、dlt、prfA、virR、hfq与粘附、调控有关的毒力基因在动物源食品分离株和在植物源食品分离株中差别不明显;hfq、dltC和iap 3个基因的检出率最高,分别达到94.68%,93.36%和91.03%,可作为该地区食源性单增李斯特氏菌鉴定的参考基因。     

七类食品单核细胞增生性增李斯特菌污染状况调查

利用李斯特显色培养基对食品中单增李斯特菌进行分离纯化后,提取基因组DNA,用PCR技术扩增hlyA基因特异性350bp的片段和iap基因特异性1500bp的片段,用此方法对七类食品进行检测。结果表明,冬春夏三季采集的62、60、62份样品中,分别检出单增李斯特菌3株、3株、10株,污染率分别为4.84%、5%、16.13%。夏季单增李斯特菌的污染情况比冬季和春季严重,其中蔬菜和牛奶中未检出单增李斯特菌;PCR检测可用于单增李斯特菌快速、特异、敏感检测。     

β-伴大豆球蛋白α-亚基核心区的基因克隆、表达及纯化

利用RT-PCR技术获得了齐黄34大豆种子的全长cDNA,采用自行设计的引物对目的基因αc进行扩增,并将目的基因与载体连接,构建了重组克隆载体pGEM-α_c。重组克隆载体经XhoⅠ/EcoRⅠ双限制酶酶切鉴定后,与载体pET-28a连接构建重组质粒pET-28a-α_c,经菌落PCR、双限制酶酶切及测序判定准确后,将其转入到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,当诱导温度为37℃、菌液OD_(600nm)值为0.8、诱导剂(IPTG)浓度为0.2mmol/L,诱导时间为9h时,重组α-亚基核心区蛋白分子质量为50kU;工程菌pET-28a-α_c-BL21经超声破裂、低温离心后,上清液利用镍离子亲和层析色谱柱经AKTA蛋白纯化系统纯化可以获得较高纯度的目的蛋白。     

番茄乙烯信号转录因子LeERF1基因克隆和蛋白表达

为研究乙烯信号转录因子的功能,提取破色期番茄果实总RNA,通过RT-PCR获得615bp全长LeERF1基因。测序结果表明,与已发表序列同源性为100%。将LeERF1基因亚克隆至载体pET-30a上,构建原核表达载体pET-LeERF1并转化到大肠杆菌BL21中。采用诱导温度37℃,诱导剂IPTG浓度1mmol/L,诱导时间3h,LeERF1表达蛋白在细菌中占菌体总蛋白的28%。     

类芽孢杆菌属β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中可溶性重组表达的优化

目的:β-葡萄糖苷酶在食品工业领域具有广泛的应用价值,但重组表达时容易形成无活性的包涵体。通过传统诱导条件优化无法完全解决包涵体积累问题,需探索新的策略。方法:从类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp)基因组中克隆获得了β-葡萄糖苷酶基因bgl,构建到大肠杆菌表达载体p ET28a获得重组质粒p ET-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)获得重组菌BL-ETbgl,并进行诱导条件优化。进一步通过复制起始位点替换,构建了新型大肠杆菌表达载体p ACYT-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)后得到改进型重组菌BL-ATbgl。结果:BL-ETbgl经诱导表达后,所表达重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性。经诱导条件优化后,仍有40%蛋白以包涵体存在。而BL-ATbgl经诱导表达后,可溶性的重组β-葡萄糖苷酶约占80%。自诱导培养基中β-葡萄糖苷酶产量可达2.31×106U/L。结论:通过降低质粒拷贝数、优化培养条件等手段,可以大幅度提高类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中的可溶性表达水平。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.     

EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中的转导活性

目的 构建pET-28a-EGFP-Arg7重组子,观察表达的融合蛋EGFP-Arg7在细胞内的转导活性.方法 构建EGFP-Arg7(阴性对照为EGFP)序列,与pET-28a连接后,转化Ecoli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并经Ni2+.NTA纯化.纯化产物作用于HeLa细胞后用荧光显微镜观察其转导活性.结果 重组pET-28a-EGFP-Arg7经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确.转化E.coil BL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达.纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.重组蛋白EGFP-Arg7作用于HeLa细胞后用荧光显微镜可观察到强绿色荧光.结论 Arg7具有很好的转导活性,能携带与其连接的蛋白质穿过HeLa细胞膜.     

麻疹病毒N蛋白原核表达纯化条件的优化

通过构建重组表达质粒,诱导表达纯化麻疹病毒N蛋白．将麻疹病毒N蛋白基因片段与载体pET-32a（＋）相连接,通过PCR方法扩增获得重组质粒pET-32a（＋）／N,然后将重组质粒转入大肠杆菌E．coliBL21（DE3）内,并优化诱导表达时间、温度、诱导剂浓度等条件．SDS—PAGE和Western blot蛋白印迹检测表明,麻疹病毒N蛋白分子质量约为60kD,表达产物用Ni—NTA亲和层析和DEAE纯化后,纯度达90％．     

密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆及其表达条件的优化

为克隆、表达密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶(GI)基因xylA,并对其诱导表达条件进行初步优化。采用Slowdown PCR方法克隆得到密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)CICIM B0118(A)的葡萄糖异构酶基因xylA,构建pET-28a(+)-xylA 表达载体,并转化至E. coli BL21 (DE3),经异丙基-β -D- 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对其表达产物进行SDS-PAGE 电泳。结果表明,融合蛋白分子质量约为45kD。在诱导时间9h、0.6mmol/L IPTG、30℃和OD600nm 值为0.8 的最适培养条件下,酶比活力最高达到62.42U/mL。     

鲜味八肽的表达载体构建及表达效果验证

鲜味肽是近年来新发现的呈味物质,但国内外对其呈味效果存在争议。导致这一争议的可能原因是验证鲜味肽呈味效果的方法主要是采用化学合成法。为了制备生物源鲜味肽,以便对鲜味肽呈味效果进行再评价,本文以争议性鲜味八肽为目标肽,采用基因工程法,构建了制备生物源鲜味肽的表达载体,并对其表达效果进行了验证。根据争议性鲜味八肽的一级结构Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala和大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的密码子偏爱性,设计了该鲜味八肽的DNA序列,并将其克隆在pET-32a(+)上形成表达载体。通过菌落PCR检测阳性克隆、重组质粒鉴定及工程菌的诱导表达,结果发现,鲜味八肽的目的基因成功重组在pET-32a载体上,所得pET-32a鲜味肽重组载体转化大肠杆菌后能够正常表达融合蛋白。这为后续获得生物源鲜味八肽奠定了基础。     

腰果主要过敏原Ana o 2原核表达及免疫学鉴定

目的 构建Ana o 2重组表达质粒,原核表达重组蛋白并评价其免疫活性。方法 将Ana o 2基因构建到pET-28a(+)载体中,测序正确的重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,诱导表达目的蛋白并进行质谱鉴定。利用腰果过敏阳性血清,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白质免疫印记(Western blot)法评价重组Ana o 2的免疫活性。结果 重组蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明分子量为54 kD,与理论值相符,经质谱鉴定为Ana o 2。ELISA结果显示,用重组Ana o 2检测腰果过敏阳性血清与阴性血清特异性IgE抗体(sIgE)水平差异有统计学意义(t=2.44,P<0.05)。Western blot结果表明,重组Ana o 2与腰果过敏患者血清反应性良好。结论 利用原核系统表达了Ana o 2,并且重组Ana o 2与腰果过敏患者血清具有良好的反应性。     

金黄色葡萄球菌M型肠毒素原核表达、纯化、鉴定及溶液构象分析

葡萄球菌肠毒素M是由金黄色葡萄球菌νSa基因岛编码的分泌型超抗原。本研究将截去N端信号肽的金黄色葡萄球菌M型肠毒素(staphylococcal?enterotoxin?M,SEM)蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒p ET-28a(+)-ΔNspsem;随后转化感受态E.coli?Rosetta(DE3)并探讨融合蛋白最佳表达条件;利用Ni2+-Sepharose?4?Fast?Flow亲合层析纯化出His-ΔNsp SEM融合蛋白;经质谱鉴定,纯化的融合蛋白对SEM的氨基酸覆盖率达96.3%;凝血酶切除6×His标签肽后,圆二色谱分析表明ΔNsp SEM重组蛋白富含β-折叠(35%)和β-转角(21%)以及较少α-螺旋(16%)等二级结构;荧光发射谱揭示ΔNsp SEM在278?nm和295?nm波长处激发时具有相同的Trp发射峰(341?nm);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析表明ΔNsp SEM重组蛋白表现出较高的热稳定性。研究结果表明重组蛋白SEM表达成功,纯化的ΔNsp SEM重组蛋白溶液构象紧密并具有接近天然状态的结构,这为深入研究SEM蛋白的结构与功能提供理论支持。     

不同质粒表达大肠杆菌碱性磷酸酶的研究

目的比较以pET-30a和pET-22b两个质粒表达碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)的活性差异。方法以质粒pET-30a-AP为模板,克隆大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)ATCC 25922的碱性磷酸酶成熟肽基因,并构建重组表达质粒pET-22b-AP。将这2种表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达AP。对温度和甲醇对AP活性的影响进行研究。结果 pET-30a-AP所产AP浓度约为pET-22b-AP 10倍时,才可达到类似催化效果;表达自pET-22b-AP质粒的AP对甲醇的耐受性略好于pET-30a-AP。结论本研究可为AP的生产及基因工程抗体-AP融合蛋白在类似ELISA等免疫检测方法的应用提供重要的参考依据。     

T4 DNA聚合酶在大肠杆菌中高效表达、纯化及部分生物学活性分析

T4 DNA聚合酶（T4 DNA polymerase,T4 DP）是基因工程等相关领域中不可缺少的工具酶。为获得大量高纯度并具有生物活性的可溶性T4 DP,通过从T4噬菌体基因组中克隆出T4 dp基因,将其克隆到pET-22b（＋）质粒中构建重组表达载体pET-22b（＋）-T4 dp,经DNA测序检测成功后,转化到大肠杆菌Transetta（DE3）中进行自诱导表达,通过磁珠法高效准确检测T4?DP的可溶性表达情况,并对自诱导的温度和时间进行优化,确定最佳诱导条件为30?℃诱导培养10?h,分别利用超声波法、超声波-溶菌酶法及化学裂解法对自诱导表达的重组菌体进行破碎,确定最佳破碎方法为化学裂解法,分别利用Ni SepharoseTM 6 Fast Flow亲和层析柱和MagNi磁珠纯化重组菌体裂解后上清液中的T4 DP,MagNi磁珠能高效地纯化出高纯度的T4 DP,其质量浓度为3 073.960 μg/mL,成功获得了高纯度高质量浓度的可溶性T4 DP,并使其成功应用于克隆载体的构建,证明其具有较好的末端平滑化活性。