白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶基因PDS3的克隆与序列分析

利用电子克隆技术,从数据库中找到与拟南芥高度同源的油菜EST序列,继而通过RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶（类胡萝卜素合成途径中的一个关键限速酶）基因PDS3的cDNA,命名为BrPDS3（GenBank登记号GQ200741）。cDNA序列全长1 940bp,其中包含114bp的5＇前导序列和134bp的3＇不翻译序列,编码区长度为1 692bp,编码63kD的蛋白。序列分析表明,BrPDS3蛋白与其他植物的PDS蛋白具有较高相似性;在系统进化树中,BrPDS3与甘蓝亲缘关系最近。根据全长cDNA序列设计引物,从白菜型油菜青油13号DNA中克隆得到BrPDS3基因的全长DNA,长度为3 911bp,ORF（开放阅读框）1 692bp,含有15个外显子和14个内含子。     

巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)类胡萝卜素生物合成途径中的上游关键酶。本研究根据NCBI上已发布的巴氏杜氏藻mRNA序列(GenBank:Y14807),设计特异性引物,通过基因组步移法及半巢式PCR的方法,获得PDS编码区序列。在编码区序列获取过程中,发现5’端编码区有325 bp序列与NCBI上公布的cDNA序列有所不同,故采用了5’RACE技术进行验证,经过比对发现结果与本实验基因组步移所获得序列相匹配,推测NCBI公布mRNA序列的PDS与本实验获取的PDS可能为同工酶。然后根据获得的序列,再利用基因组步移PCR的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对其进行分析。实验获得的完整PDS基因全长12678 bp,其中编码区序列长度为8113 bp,编码区上游序列3010 bp,编码区下游序列1555 bp,编码区序列含有12个外显子和11个内含子。通过生物信息学分,发现PDS启动子中具有多种转录因子结合位点。     

盐藻八氢番茄红素脱氢酶cDNA的分离及序列分析

采用5’和3’RACE技术和梯度PCR方法从盐藻中克隆了八氢番茄红素脱氢酶(Pds)全长cDNA,序列分析表明,该cDNA长2198bp,包含1个1752bp的开放阅读框(ORF),编码一段583氨基酸残基的多肽链。氨基酸序列的同源性分析表明,它与高等植物和蓝藻的八氢番茄红素脱氢酶序列一致性高达67%,而与细菌和酵母的序列同源性较差;在N端具有一段转运序列和辅助因子结合结构域,C端则有一胡萝卜素结合域。这些序列特征预示,盐藻Pds与其他绿藻、高等植物和蓝藻中的同源基因一样催化八氢番茄红素发生前2步脱氢反应,并且需要与另一个脱氢酶联合作用合成番茄红素。     

烤烟八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析

利用同源性克隆方法,从烤烟栽培品种K326(Nicotiana tobacum K326)中克隆获得烤烟八氢番茄红素合成酶基因的全长cDNA序列(命名为T-psyl),GenBank中的登录号为HM345582,该基因全长为巧21 by,编码的蛋白含441个氛基酸,蛋白登录号为ADK25054,Blast搜索结果及进化分析结果表明,该基因序列与观赏烟草、番茄和辣椒的八氢番茄红素合成酶基因同源性分别为95%,91%,86%.其编码蛋白与观赏烟草、番茄、牛奶子的PSY基因编码蛋白一致率分别为97%,90%和74%.     

白菜型油菜八氢番茄红素合酶基因BrPSY的克隆与序列分析

八氢番茄红素合酶（PSY）是类胡萝卜素合成途经的第一个关键限速酶,对类胡萝卜素合成起着重要的控制作用。本研究利用电子克隆技术,从油菜EST数据库中找到与拟南芥PSY,基因高度同源的油菜EST序列,通过人工拼接及lit—PCR、RACE的方法,克隆得到白菜型油菜BrPSY基因全长eDNA的序列,提交GenBank,被命名为BrPSY（GenBank登记号EUl38883）。BrPSY包含168bp的5’前导序列、69bp的3’不翻译序列和1278bp的完整开放读码框（ORF）,编码47．6kOa的蛋白质。序列比对结果表明,BrPSY蛋白与其它植物的PSY蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,BrPSY与拟南芥亲缘关系最近。在全长eDNA序列的基础上,设计引物从白菜型油菜DNA中克隆得到BrPSY基因的全长DNA序列,含有7个外显子和6个内含子。     

盐藻八氢番茄红素合成酶基因组DNA的克隆及序列分析

八氢番茄红素合成酶(PSY)为盐藻β-胡萝卜素代谢途径中的一个关键酶。通过染色体步移技术，采用抑制性PCR，从盐藻基因组DNA中克隆到完整的PSY基因，并对其序列进行了分析。该PSY基因序列全长3315bp，由5个外显子和4个内含子组成。其编码区的氨基酸序列与巴氏杜氏藻相应序列的一致性最高为74％，不一致区主要集中在5’端。同源性分析表明盐藻与巴氏杜氏藻的亲缘关系最近。     

巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶侧翼调控序列的克隆与分析

研究表明八氢番茄红素合成酶( PSY)是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)类胡萝卜素代谢途径中的第一个关键调节酶.本实验采用基于LAoPCR的基因组步移法分别设计两组基因特异引物pSP1-3及tSP1-3,克隆巴氏杜氏藻PSY( DbPSY)的启动子和终止子序列,并利用在线启动子分析软件分析其保守调控序列.最后利用生物信息学方法分析预测DbPSY的蛋白质结构.分析结果表明,DbPSY启动子具有两个保守调控序列:BOXLCOREDCPAL和GT1GMSCAM4,其中BOXLCOREDCPAL受紫外光诱导,上调下游基因的表达,GT1GMSCAM4受盐调控,促进下游基因的表达.蛋白结构分析表明,DbPSY的N端在邻近物种间具有较大的多样性.我们推测DbPSY的微调与启动子保守序列及蛋白质N端序列的多样性相关.     

水稻种子中特异表达IPT基因植物载体的构建

以水稻品种9311为材料,PCR扩增种子中特异表达的PG—5α基因启动子,并将此启动子与pCAMBIA 1300相连接,成功地构建了pCAMBIA1300-pPG5α-IPT-Nos植物表达载体,为改善水稻品质,提高水稻产量奠定基础。     

盐藻八氢番茄红素合成酶基因组DNA的克隆及序列分析

八氢番茄红素合成酶(PSY)为盐藻β-胡萝卜素代谢途径中的一个关键酶。通过染色体步移技术,采用抑制性PCR,从盐藻基因组DNA中克隆到完整的PSY基因,并对其序列进行了分析。该PSY基因序列全长3315bp,由5个外显子和4个内含子组成。其编码区的氨基酸序列与巴氏杜氏藻相应序列的一致性最高为74%,不一致区主要集中在5'端。同源性分析表明盐藻与巴氏杜氏藻的亲缘关系最近。     

抗菌肽Japonicin Ⅱ基因真核表达载体的构建

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽Japonicin Ⅱ基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上，经PCR鉴定及序列分析，所转化的毕赤酵母GS115中含有插入Japonicin Ⅱ基因的重组质粒pPICZαA-Jap，结果表明成功构建了抗菌肽JaponicinⅡ基因真核表达载体pPICZαA-Jap。     

番茄果实特异表达载体pBI121-2A11-HB-1的构建及其对农杆菌的转化

为了解乙烯生物合成调控机理,本研究利用聚合酶链式反应技术,从番茄Micro-Tom中克隆2A11果实特异型启动子和LeHB-1基因,构建LeHB-1正义和反义果实特异表达载体,并导入根癌农杆菌GV3101中,为下一步通过转基因操作来研究转录因子LeHB-1在果实发育过程中的生物学功能奠定了实验基础。     

Green-ripe(Gr)基因植物表达载体的构建及在Micro-Tom番茄中的遗传转化

Green-ripe(Gr)是一种番茄果实成熟突变体,有报道表明番茄中的Gr基因以某种形式参与乙烯信号转导途径,导致番茄果实成熟过程中的乙烯不敏感特性。从番茄果实中克隆Gr基因,成功构建Gr基因的植物表达载体pCAMBIA-1300-Gr,并以Micro-Tom番茄品种为材料,采用农杆菌介导叶盘法转化得到转基因植株,经PCR初步验证为阳性植株,为进一步研究Gr基因的功能奠定了基础。     

dhaT基因克隆及其与gldABC基因串联表达载体的构建

以肺炎克雷伯氏菌As1.1736的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了目的基因(dhaT)并将该基因克隆至pMD19-T Simple载体。基因的序列分析表明,dhaT基因全长为1164bp,编码387个氨基酸。将含有自身核糖体结合位点的dhaT基因片段插入到pMD19-T Simple/gldABC质粒的gldABC基因下游,形成重组克隆质粒pMD19-T Simple/gldABC-dhaT,并进一步将gldABC与dhaT串联基因亚克隆到表达载体pET28a(+)上。     

花粉管通道法验证花生Oleosin基因启动子的特异性表达

油体蛋白（Oleosin）是一类覆盖在油体表面且仅在种子中特异表达的低分子质量蛋白,能维护油体的稳定性。本研究利用花生Oleosin基因的启动子替换了pCAMBIA1301的35S启动子,构建了重组表达载体pCAMBIA1301-Oleosin-pro,利用花粉管通道法导入花生。对T0代转基因植株进行了PCR鉴定和GUS组织化学染色,结果显示：50株转基因植株有9株能扩增出目的条带,阳性率为18%,9株阳性转基因植株中有5株的子叶能被GUS染色。对GUS染色成阳性的转基因植株的子叶进行切片观察,结果显示Oleosin基因启动子驱动的GUS基因在油体蛋白中表达。     

带自身启动子的bgaB基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的启动子连同β-半乳糖苷酶bgaB基因经PCR扩增后,连接在T载体上,再取代枯草杆菌载体pZ01-bgaB的启动子,将其在枯草杆菌宿主WB600中表达.经摇瓶发酵20h,得到乳糖酶活力6.37U/mL,比活力3.814U/mg,SDS-PAGE电泳显示有明显重组蛋白质条带.证明了嗜热脂肪芽孢杆菌来源的启动子在枯草杆菌中是完全适用的.     

番茄NF-Y转录因子生物信息学分析及其与RIN共同调控果实成熟研究

运用生物信息学分析方法,对番茄NF-Y家族59个成员的结构域和进化关系进行分析,并比较番茄NF-Y基因在番茄野生型AC及rin突变体果实成熟过程中的表达量变化,结合转录因子RIN对NF-Y基因DNA的结合能力,分析其可能的互作关系。研究结果为阐述番茄NF-Y转录因子与RIN共同调控果实成熟的功能提供理论依据。     

果色和成熟度对樱桃番茄(Solanum lycopersicum var.cerasiforme)果实挥发物分布的影响

为探究果色和成熟度对樱桃番茄果实挥发物的影响,用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法测定育种自交系材料金珠(橙)、黑樱桃1(紫)、1号(粉)、红珍珠(红)在绿熟期、转色期和红熟期的挥发物.分析发现,橙色番茄挥发物明显高于红色和粉色番茄.橙色番茄在绿熟期,紫色番茄在转色期和红熟期挥发物最高,而粉色番茄挥发物始终最低.气味...     

鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽融合基因植物表达载体的构建

根据基因工程操作方法和植物偏爱密码子原则,设计了鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽融合基因,并在融合基因前端加上AMV RNA4 5＇-UTR 序列和6 × His 标签,在融合基因后边加上一个甘氨酸。通过Sac I 和Sma I双酶切pUC(AMV / CGRP / msCT)获得融合基因,用T4 DNA 连接酶连到植物表达载体pBI121 上,构建重组质粒pBI AMV / CGRP / msCT,再转化到E.coli DH5α中保存。通过DNA 测序验证表达载体构建成功。