一株食窦魏斯氏菌的分离鉴定及其质粒的序列分析

目的:探究四川泡菜中含质粒的乳酸菌,并对质粒进行序列和功能分析。方法:采用平板涂布法和碱裂解法分离含质粒乳酸菌,通过菌落形态、生理生化和16S rDNA序列分析法对其进行鉴定。利用单酶酶切质粒,并在测序质粒片段的基础上设计引物扩增质粒的剩余片段,对拼接成功的质粒进行序列分析。结果:从四川泡菜中分离出一株含质粒的食窦魏斯氏菌W5(Weissella cibaria)。该菌株中质粒pA010全长为11630 bp,GC含量为34.6%,编码了4个可识别功能蛋白,包括酪氨酸重组酶、复制蛋白、抗毒素PemI和毒素PemK。比较酪氨酸重组酶和复制蛋白,推断该质粒为θ型复制质粒。其中PemI和PemK构成的Ⅱ-TA系统对质粒的稳定有一定作用且可能提升食窦魏斯氏菌对周围环境的适应力。结论:食窦魏斯式菌W5是一株含质粒乳酸菌,其序列分析为构建耐受环境胁迫的载体提供了可能。     

植物乳杆菌天然质粒分类

为建立植物乳杆菌天然质粒分类方法,以质粒复制起始蛋白(replication initiation protein,Rep)作为分类标记,通过系统进化树分析方法,将植物乳杆菌53个编码Rep天然质粒划分为6个质粒类型,包括5个质粒家族和1个新的复制类型质粒,之后进一步提出了每个质粒家族特有的骨干序列,最终建立了一种简单、有效的植物乳杆菌天然质粒的分类方法和标准。与以往质粒功能和不相容性分类方法相比较,本方法具有较好的实用性和通用性。     

植物乳杆菌P8亚油酸异构酶基因及其上游非编码区的克隆与分析

依据GenBank中已公布的亚油酸异构酶基因,设计一对特异性引物,PCR扩增该基因后,克隆到T载体上并转化到Trans1-T1感受态细胞中。经菌落PCR鉴定和序列分析表明,亚油酸异构酶基因大小为1720bp。该基因与植物乳杆菌AS1.555(DQ227322)的同源性达到99%,与泡菜植物乳杆菌(DQ010331)的同源性达到89%。该基因序列在GenBank上注册,编号为HM569265,对其进行生物信息学分析发现,基因中含有一段低复杂性区域。分析乳酸杆菌(CP001617)基因组全序列,设计了亚油酸异构酶基因上游非编码区805bp片段的特异性引物,PCR扩增该片段后将其克隆到T载体上并转化到Trans1-T1感受态细胞中。经菌落PCR鉴定后,进行序列分析和生物信息学的初步分析,预测出该片段中有12个基序,以及6个转录调控元件。     

短乳杆菌天然质粒分类

为建立短乳杆菌天然质粒分类方法,通过质粒复制起始蛋白（replication initiation protein,Rep）进化树和基因组共线性分析,将短乳杆菌51 个天然质粒可以准确、有效地划分为6?个家族类型和11?个亚家族类型,并在家族4质粒中发现了一种新的复制子类型。研究结果表明,质粒Rep进化树和基因组共线性分析都是短乳杆菌天然质粒有效的分类方法,分类结果为今后短乳杆菌天然质粒科学分类和理性应用提供了理论研究依据。     

降胆固醇植物乳杆菌差异表达蛋白的筛选与鉴定

目的:运用蛋白质组学技术研究降胆固醇能力不同的植物乳杆菌中差异表达蛋白,探讨植物乳杆菌降胆固醇作用机理。方法:分别提取植物乳杆菌和诱变植物乳杆菌的菌体蛋白,利用双向电泳和质谱技术筛选并鉴定两株菌的差异表达蛋白,对鉴定的差异表达蛋白进行生物信息学分析,运用荧光定量PCR方法分析其中差异表达蛋白在两株菌中的m RNA表达水平。结果:与植物乳杆菌M1相比,植物乳杆菌UVs29中差异表达蛋白共190个,选取30个进行质谱鉴定,得到24种差异表达蛋白,荧光定量PCR结果显示:植物乳杆菌UVs29中烯醇化酶、果糖-二磷酸醛缩酶、未知蛋白的m RNA表达量高于植物乳杆菌M1,腺苷酸激酶的m RNA表达量则低于植物乳杆菌M1。结论:应用双向电泳和质谱技术分离鉴定出24种差异表达蛋白,荧光定量PCR的4种差异表达蛋白的m RNA表达量可能对植物乳杆菌降胆固醇作用产生影响。     

传统发酵酸牛奶中乳酸菌多态性分析

以从内蒙古呼伦贝尔市牧区采集的1份传统发酵酸牛奶样品为研究对象,对其进行乳酸菌的分离鉴定。通过传统纯培养法分离出17株菌,并对17株菌进行16SrDNA序列分析、多位点pheS序列分析和生理生化鉴定,鉴定的结果为11株乳酸乳球菌乳酸亚种、1株格式乳球菌、1株粪肠球菌、2株植物乳杆菌植物亚种及2株弯曲乳杆菌。乳酸乳球菌乳酸亚种为优势菌(占总分离菌株的64.7%)。     

广谱抑菌乳酸菌的筛选及其细菌素相关基因分析

采用琼脂扩散法,从分离自新疆传统酸奶的8株乳酸菌中筛选出1株抑菌效果较好并具有广谱抑菌性的菌株B6,通过革兰氏染色、生理生化及16S rDNA序列比对,鉴定该菌为植物乳杆菌。植物乳杆菌B6发酵液经排除酸、过氧化氢实验后,仍有抑菌效果,且对蛋白酶敏感,判定该菌产细菌素。通过设计10对编码合成细菌素相关基因的特异性引物,以菌株B6的DNA为模板,进行聚合酶链式反应快速鉴定。结果表明,菌株B6含有编码IIb类细菌素结构基因plnE/F/J/K,plnJ与植物乳杆菌C11相比,序列仅在前导肽区出现一处氨基酸突变,相似度为99%,plnE/F/K序列与植物乳杆菌C11的这3个基因序列完全相同。因此鉴定植物乳杆菌B6产生的是IIb类细菌素。     

植物乳杆菌NP_785232蛋白N端两个特定结构域在大肠杆菌中的诱导表达

以植物乳杆菌KLDS1.0320的候选表面黏附蛋白NP_785232为研究对象,采用外源重组表达的方法大量制备其前两个结构域。应用聚合酶链式反应方法克隆NP_785232蛋白N端的前两个结构域,将克隆获得的片段连入表达载体pET30a中构建重组质粒pET30a/N2,该重组质粒转化大肠杆菌后,用终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷诱导重组菌,重组蛋白经HisTrap柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对电泳获得的目的大小的片段进行质谱鉴定。结果表明：获得的重组蛋白与NP_785232蛋白N端的前两个结构域完全相同。通过大肠杆菌表达系统可以有效表达植物乳杆菌KLDS1.0320的候选表面黏附蛋白NP_785232 N端的前两个结构域。     

建始地区酸豇豆盐水细菌多样性及乳酸菌分离鉴定

该研究采用MiSeq高通量测序技术对酸豇豆盐水的细菌多样性进行了解析,并通过纯培养方式分离了其中的乳酸菌。结果发现,细菌以硬壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为主,平均相对含量分别为84.41%和10.52%;细菌属以乳酸杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和片球菌属（Pediococcus）为主,平均相对含量分别为57.02%、9.33%、7.07%、4.73%和3.40%;发现44个操作分类单元（OTU）存在于所有样品中,所包括序列占总序列数的25.06%,其中有6个、11个和13个分别被鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas）、魏斯氏菌属（Weissella）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）,所含序列平均含量分别为4.61%、4.97%和14.46%;通过纯培养共分离出了13株乳酸菌,其中12株被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。由此可见,乳酸杆菌为建始地区酸豇豆盐水中的优势细菌,且乳酸杆菌主要为植物乳杆菌。     

乳杆菌表层蛋白对菌株表面特性和益生特性的影响

为评估乳杆菌表层蛋白对菌株特性的影响,该研究通过序列比对筛选出含slp基因的乳杆菌,之后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对其中部分菌的slp基因表达情况进行鉴定,并测定了表层蛋白去除前后菌体生长的吸光度值、自聚集率、自成膜量、与致病菌共聚集率等特性。结果表明,4株嗜酸乳杆菌、30株卷曲乳杆菌、3株瑞士乳杆菌、30株鼠李糖乳杆菌都含有slp基因,经过SDS-PAGE鉴定了四种菌的部分菌株均表达表层蛋白,且其表层蛋白与菌株的特性密切相关。比如,在生长方面,瑞士乳杆菌去除表层蛋白前后生长能力差异很大,但氯化锂溶液和蛋白酶K两种溶液处理的吸光度值差距较小,差值仅在0.2以内;在与致病菌共聚集方面,大部分菌株在不同处理过程中没有较大差异,有趣的是,本身自聚能力弱的鼠李糖乳杆菌3-1表现出来的与致病菌极强的共聚能力,这株菌的在口腔方面的防龋潜力值得进一步探究。该研究丰富了人们对乳杆菌表层蛋白的了解,为深入探究表层蛋白的功能和应用奠定理论基础。     

Molecular cloning of the gamma-glutamylcysteine synthetase gene of Saccharomyces cerevisiae.

The 4.4 kb SphI DNA fragment (GSH1) that complements the gamma-glutamylcysteine synthetase-deficient mutation (gsh1) of Saccharomyces cerevisiae YH1 was cloned into vector plasmid YEp24. Gene disruption of the cloned fragment confirmed that this segment was the same gene as gsh1. Mutant strain YH1 with this plasmid not only restored gamma-glutamylcysteine synthetase (GSH-I) activity but the glutathione content and the growth rate. DNA sequence analysis of the SphI fragment showed that the GSH1 structural gene contained 2034 bp and predicted a polypeptide of 678 amino acids. The deduced amino acid sequence had about a 45% homology to that of rat kidney GSH-I, but a very low homology (about 26%) to that of Escherichia coli GSH-I. Northern analysis showed that GSH1 had been transcribed into an approximately 2.7 kb mRNA fragment. Southern analysis showed that GSH1 mapped at chromosome X.     

生物合成γ-氨基丁酸酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

为了提高酵母菌的γ-氨基丁酸产量,本研究以十六烷基三甲基溴化铵法(hexadecyl trimethy ammonium bromide,CTAB)提取的酿酒酵母28基因组DNA为模板,扩增得到序列长度为1 758 bp的GAD1基因,经比对与S.cerevisiae S288c的一致性达到98.58%,并设计引物扩增包括GAD1基因上游启动子及调控序列,下游终止子在内的全长基因序列,长度为3 490 bp。将全长基因序列克隆至高拷贝质粒p UG6,构建重组质粒p28。以菌株28作为出发菌株进行转化,经G418抗性筛选得到转化子,进一步经过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)实验验证,质粒提取及酶切验证,确证得到重组子DL28。经重组质粒p28的特性研究得知,重组质粒p28具有良好的遗传稳定性,无抗性传代培养10次重组质粒不丢失。转化后进行酶活力测定,重组子DL28的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)酶活力比菌株28提高73.8%。通过以上实验结果得出结论,GAD基因高表达菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性。     

多糖奈瑟球菌中淀粉蔗糖酶基因的克隆及表达载体的构建

根据不同类型的奈瑟氏球菌中的淀粉蔗糖酶（amylosucrase）基因的保守序列设计引物,通过TD—PCR扩增的方法克隆出多糖奈瑟球菌ATC043768基因组中编码淀粉蔗糖酶的基因Ams2,将其与pMD～18T载体连接,得到重组质粒T—Ams2。序列测定及生物信息学分析结果表明,Ams2基因由1911个碱基组成,编码6j7个氨基酸,Ares2与多糖奈瑟球菌ATCC85322菌株的同源性达g6％,对应的氨基酸同源性为97％。将该基因插入表达质粒pET-28a中,构建重组质粒pET28a～Ares2,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。     

异淀粉酶产生菌的分离鉴定及异淀粉酶基因的克隆表达

目的:为了进一步提高淀粉的利用率,从微生物中获得高产量异淀粉酶的菌株。方法:本实验从富含淀粉的土壤中筛选出1株高产异淀粉酶的菌株,命名为LZ-5,通过菌落形态观察、生理生化特性实验、16S rDNA序列及gyrB基因分析,构建系统发育进化树并对其进行鉴定;根据NCBI上的迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)异淀粉酶基因设计引物,扩增出异淀粉酶基因后,以pMD-18T为载体,构建重组质粒,导入到E.coli DH5a感受态细胞,挑选阳性重组质粒进行酶切鉴定及表达产物的检测。结果:LZ-5鉴定为枯草芽孢杆菌,所产异淀粉酶酶活力为10.9 U/mL;测序结果与NCBI上报道的异淀粉酶基因相似度达到96%,表明将枯草芽孢杆菌的异淀粉酶基因成功转化到大肠杆菌中。经IPTG诱导表达,构建的大肠杆菌工程菌,通过细胞破碎仪破碎后,测得异淀粉酶酶活力为28.4 U/mL,是菌株LZ-5的2.6倍。结论:细菌异淀粉酶基因重组表达是解决异淀粉酶活力低的主要策略之一。     

1株具有高产木二糖的产木聚糖酶马特链霉菌的鉴定

对1株具有高产木二糖的产木聚糖酶马特链霉菌进行了鉴定。从土壤中新分离得到1株具有产木聚糖酶活性的链霉菌sp.67,对该菌株进行了形态特征、培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析等方面的鉴定。PCR扩增得到其16s rDNA序列为1481 bp,通过在NCBI上BLAST比对,并运用ClustalX 1.8和MEGA 3.1软件绘制系统发育树,分析结果表明,sp.67与S.matensis AB 184221菌株同源性为99.52%。结合与生理生化实验结果一致,初步鉴定sp.67为马特链霉菌(Streptomyces matensis)。该菌株所产木聚糖酶水解碱处理棉籽饼的主要产物为木二糖,在生产高纯度木二糖中具有潜在的应用价值。     

Physical separation and functional interaction of Kluyveromyces lactis and Saccharomyces cerevisiae ARS elements derived from killer plasmid DNA

Two DNA fragments which have autonomously replicating sequence (ARS) activity in both Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis have been isolated from the K. lactis kl killer plasmid. One fragment (Kla1) is 700 base pairs (bp) in length and plasmids carrying it are mitotically unstable in both hosts. In K. lactis, this instability leads to colonies having a 'nibbled' phenotype when grown on selective media and appears to be the result of inefficient plasmid segregation. The other fragment (Kla2) is an artificial junction fragment of 1100 bp which was produced during the cloning procedure. Kla2 has been divided into two sub-fragments Kla2A and Kla2B which have, respectively, ARS activity in K. lactis and S. cerevisiae but not the other species. This indicates that these two closely related yeasts have different sequence requirements for ARS activity. Kla2B contains a perfect match to the S. cerevisiae ARS consensus but Kla2A does not. Both Kla2A and Kla1 share a 10 bp sequence as the sole region of homology between them. This sequence, 5'TCATAATATA3', is tentatively offered as defining the ARS consensus sequence for K. lactis.     

Cloning and functional analysis of the orotidine-5'-phosphate decarboxylase gene (PbrURA3) of the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis

A genomic clone encoding the Paracoccidioides brasiliensis orotidine monophosphate decarboxylase gene (PbrURA3) was isolated by screening a subgenomic plasmid DNA library of this fungus, using a PCR amplification product of the gene as a probe. Sequence analysis revealed that the gene contains an open reading frame of 855 bp with a single intron (162 bp), and encodes a putative 285 amino acids polypeptide of estimated molecular weight 31.1 kDa and isoelectric point 6.5. The deduced amino acid sequence predicted a 73.4% identity with orotidine monophosphate decarboxylase of Aspergillus nidulans. Functionality of the gene was demonstrated by transformation into a Saccharomyces cerevisiae ura3 null mutant.