短小芽孢杆菌热稳定环糊精葡萄糖基转移酶粗酶酶学特性研究

从土壤分离物中筛选到一株环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferase,CGTase)产生菌CGT01.16SrDNA序列分析表明该菌与短小芽孢杆菌(Bacillus pumnilus)的同源性为99%.同时根据其生理生化特征,该菌株被鉴定为短小芽孢杆菌(B.pumilus).命名为B.pumilus.CGT01菌株.产生CGTase的最适初始pH为6.5,最适培养温度为37℃.菌株所产CGlke的最适pH值和最适反应温度分别为pH 6.5和60℃,并有较高的热稳定性.60℃条件下保温,酶活基本稳定,半衰期为35 min.酶液中添加1 mmol/L Ca2+能明显提高CGTase的稳定性,60 ℃保温1 h后,剩余酶活仍达80%以上.SDS-PAGE检测表明酶的分子量约为78 ku左右.经高效液相色谱分析表明,CGTase作用于可溶性淀粉后的主要产物为葡萄糖、麦芽糖和β-环糊精,没有检出α和γ型环糊精产物,因此所产环糊精为单一类型,不同于同种属的其他菌株所产CGTase.     

L-谷氨酸氧化酶的分离纯化及酶学性质的研究

采用硫酸铵分级沉淀、HPLC脱盐、离子交换、Superdex G-200凝胶层析等步骤从华美链霉菌(Streptomyces sp.)发酵液中分离纯化L-谷氨酸氧化酶(GLOD),经过SDS-PAGE电泳检测,样品达到电泳级纯,分子量为140ku。对纯化的GLOD研究发现,该酶的最适反应温度为50℃,最适pH值为7.0,温度稳定范围为0℃～50℃,pH稳定范围在6.0～9.0,GLOD催化L-谷氨酸的米氏常数Km为2.1×10-4mol/L,Na+、K+、Mg2+对酶活几乎没有影响,而Hg2+、Cu2+、Ag+均不同程度的抑制酶的活性。     

产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株筛选、鉴定与酶学性质的初步研究

从上海浦东新区新场镇某农场种植田筛选出1株高产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株,初步研究其酶学性质,以获得有良好热稳定性和pH稳定性的酶。通过形态学特征、生理生化试验鉴定和16S rRNA序列比对分析,确定该菌株为浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans),命名为P.macerans TLLY7。酶学性质测定结果表明,该酶的酶活性为1.35 U/mL,其最适反应温度为50℃、最适反应pH值为6.0,并且在40~45℃、pH 6.0~9.0稳定性良好。Ca²⁺、Mn²⁺和Zn²⁺对酶表现出促进作用,Fe²⁺、Cu²⁺和Co²⁺则对该酶表现出抑制作用。其中Ca²⁺对酶的促进作用最强,酶活性促进率为25%,Cu²⁺对酶的抑制作用最强,酶活性抑制率为33%。K⁺、Mg²⁺对酶活性的影响较小。菌株TLLY7所产α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶学性质初步研究表明其具有深入研究的价值和应用的潜力。     

黄绿蜜环菌生物转化合成天麻素体系的葡萄糖基转移酶初步研究

黄绿蜜环菌是药用植物天麻的共生菌。研究发现黄绿蜜环菌能催化对羟基苯甲醇合成天麻素,该过程实际上是对羟基苯甲醇的转糖基反应。本文建立了一种该体系中葡萄糖基转移酶酶活测定方法,并对该葡萄糖基转移酶的最适反应温度、热稳定性、最适pH和酸碱稳定性等酶学性质进行初步研究。研究结果表明该糖基转移酶最适反应温度50℃,在30℃下酶活稳定性最高,最适反应pH6,在pH6～7范围内酶活稳定最好。     

固定化环糊精葡萄糖基转移酶的催化转苷

本文以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂共价交联固定环糊精葡萄糖基转移酶。戊二醛的双功能团醛基能够分别与壳聚糖分子中的氨基和酶分子中的氨基发生亲和加成,使得共价交联法固定的环糊精葡萄糖基转移酶不易于脱落。单因素实验结果表明:25℃、0.02g/mL的壳聚糖乙酸溶液,4%(体积分数)的戊二醛,50μL环糊精葡萄糖基转移酶,交联1h,吸附15h,固定化酶的环化酶活回收率最高能达到94.5%,比活最高为39.7U/g。以玉米淀粉水解液为糖基供体,固定化环糊精葡萄糖转移酶催化甜菊糖的转葡萄糖基反应中,固定化酶的最适催化温度提高5℃,最适催化pH不变,在非最适pH时甜菊糖的转化率提高5%8%,5h时热稳定性增强10%。     

谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及酶学性质的研究

对灰轮丝链轮丝菌ZC60所产生的谷氨酰胺转胺酶采用(NH4)2SO4盐析、透析脱盐、冷冻浓缩和SephadexG-100凝胶过滤层析进行纯化,经SDS-PAGE检测,样品达到电泳级纯。对冷冻浓缩后得到的粗酶的酶学性质进行研究,得到该酶的最适反应温度为50℃,最适pH为7.0;酶的温度稳定范围为0～50℃,pH稳定范围为6.0～7.5;K+、Na+、Ca2+、Ba2+、Mg2+对MTG的活性几乎没有影响,而Pb2+,Cu2+抑制酶活。     

巨大芽孢杆菌产胞外核糖核酸酶的分离纯化及部分酶学性质研究

巨大芽孢杆菌发酵液经硫酸铵沉淀、CM-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,纯化得到核糖核酸酶电泳纯品,并对其性质进行研究。该酶比活力为54272.27U/mg,回收率为11.37%,纯化倍数为606.67倍。该酶分子质量约为33.3kD,最适温度为52.5℃,最适pH值为8.5,在20～40℃以及pH6.0～7.0范围内稳定性较好。Fe2+、Cu2+、SDS、抗坏血酸和草酸对该酶活性有抑制作用。     

新鲜奶油中黄嘌呤氧化酶的纯化及其酶学性质

采用正丁醇处理、硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析等分离技术,从新鲜的稀奶油中纯化得到SDS-PAGE电泳纯的黄嘌呤氧化酶,其最终回收率为19.9%,纯化倍数为82.42,酶比活为8.65U/mg。该黄嘌呤氧化酶的相对分子质量约为280kDa,最适作用温度为40℃,在35℃以下比较稳定;最适pH值是8.5,在pH6.5～8.5时较稳定;Zn2+、Fe2+和K+对黄嘌呤氧化酶活性有促进作用,Ag+、Mn2+、Ca2+和SDS对黄嘌呤氧化酶活性有抑制作用。     

蕹菜叶酪氨酸酶的分离纯化与部分性质

蕹菜叶经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的酪氨酸酶。该酶活力达到114.53 U/mg,酶活力回收率为11.33%,纯化倍数为99.59。全酶分子质量为77.60 kD,亚基分子质量为38.70 kD;最适温度为45 ℃,最适pH值为7.5,该酶在25～55 ℃及pH 6.0～8.0的范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其Km值为10.05 mmol/L;甲醇、乙醇、异丙醇及柠檬酸、抗坏血酸、Ca2+和Pb2+对该酶有抑制作用,Mn2+、Zn2+和Co2+对该酶具有一定的激活作用,尿素和十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfonate,SDS）对该酶活性影响不大,Li+、K+对该酶活性基本没有影响。     

甘薯叶过氧化物酶的分离纯化及其部分性质研究

经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,从甘薯叶中得到过氧化物酶(POD)电泳纯制品。该酶比活力为91923.14U/mg,纯化倍数为255.69,回收率为1.59%。该酶分子量约为35kD,最适pH值为5.6,最适温度为60℃。该酶在20～50℃、pH4～8内稳定。以不同浓度H2O2为底物在pH7.2和25℃下测得该酶Km值为0.291mol/L。低浓度草酸、尿素、Li+、Na+、K+、Mg2+等对该酶有激活作用;SDS、KSCN、抗坏血酸(AsA)、Mn2+等对该酶有抑制作用;甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇对POD均有一定抑制作用,其抑制作用强弱顺序为异丙醇>乙醇>甲醇>乙二醇。实验表明,该酶稳定性较强。     

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae Ma83)几丁质酶的纯化及性质

由金龟子绿僵茵Ma83菌株产生的几丁质酶经硫酸铵盐盐析,Sephadex G-100柱层析,DEAE-纤维素柱层析分离纯化后,得到SDS-PAGE均一样品.酶的最适反应温度为50℃,半失活温度为65℃;酶的最适反应pH值为5.0,酶在pH4.0～7.0范围内较稳定.Ag+、Co2+、K+、Mg2+对Ma83几丁质酶有激活作用,而Hg2+、Zn2+、Pb2+对几丁质酶活力有抑制作用.经计算Ma83菌株几丁质酶对胶体几丁质的Km值为1.05 mg/mL.     

中性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质

从土壤中分离到一株高产中性植酸酶的菌株,酶活力达12.52U/mL。对其进行形态、生理、生化、分子生物学鉴定,初步鉴定为放射型根瘤杆菌(Agrobacterium radiobacter)。酶学性质研究结果表明：该酶的最适反应温度为45℃;最适反应pH 值为7.0;65℃处理60min 酶活力保持80% 左右,有一定耐热性;在pH5.5～8.0 之间,稳定性较好;Ba2+ 对酶活力有一定的激活作用,Fe2+、Mg2+、Zn2+ 和Cu2+ 对酶活力均有一定程度的抑制作用,其中Fe2+ 的抑制作用最强。     

环糊精葡糖基转移酶法改性甜菊糖的研究

目的:优选环糊精葡糖基转移酶法对甜菊糖进行结构改变的工艺。方法:以甜菊苷酶改转移率为指标,通过对影响酶改性反应的pH、甜菊苷与淀粉的比例、反应温度、反应时间、酶的用量五个因素进行考察,首先确定pH以及甜菊苷与淀粉的比例对转化率的影响,对剩余三个因素采用正交设计考察,筛选了酶改性甜菊苷的最佳工艺。结果:最佳酶改工艺组合为:pH=6,淀粉与甜菊苷的比例为2∶1,反应温度40℃,反应时间24h,酶的用量为60u/g淀粉。结论:该方法能有效对甜菊苷进行酶改,工艺合理且操作简单。     

草鱼胰蛋白酶的亲和纯化及酶学性质

从草鱼肝胰腺中提取胰蛋白酶,经匀浆、硫酸铵分级沉淀、透析得到胰蛋白酶粗酶液,通过BTI-Sepharose亲和层析一步纯化得到电泳纯的草鱼胰蛋白酶,并进一步研究该胰蛋白酶的酶学性质。结果表明：草鱼胰蛋白酶的分子质量约为27 kDa,米氏常数Km为3.4×10－5 mol/L;最适反应温度为60 ℃,在低于60 ℃条件下稳定;最适pH值为9.5,酸碱耐受范围为pH 6.0～12.0;Ba2＋、Mg2＋、Fe2＋在0～10 mmol/L范围内对该酶具有一定激活作用,而乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）、K＋在0～10 mmol/L范围内对该酶有一定抑制作用,EDTA较K＋对酶的抑制作用更明显。     

胞外弹性蛋白酶的理化特性及其影响因素

分离得到的假单胞菌(Pseudomonas sp) 菌株具有较强的分泌胞外弹性蛋白酶的能力。经微生物发酵方法生产的弹性蛋白酶,经过盐析、透析、DEAE SephadexA2 5离子交换层析、SephadexG75凝胶过滤层析等纯化步骤,从其发酵液中得到了均一的酶制品。研究结果表明,酶的最适作用温度为5 0℃;在硼砂-硼酸缓冲液中最适作用pH为8 0左右;酶在碱性环境下( pH7 0～12 0 )稳定性较好;在37℃以下,酶的稳定性较高。超过6 0℃,酶在短时间内即失活     

人参皂苷Rb3木糖苷酶的纯化及其酶学性质

采用DEAE-Cellulose DE52阴离子交换柱层析的方法对微生物Absidia sp.GRB3-X8r菌产特异性人参皂苷Rb3木糖苷酶进行分离纯化,分离后该酶在SDS-PAGE上呈现单一蛋白质条带,并对其酶学性质进行研究。研究表明:人参皂苷Rb3木糖苷酶的最适反应pH为3.0,在pH2.2~8.0范围内相对稳定;最适温度为40 ℃,在20~60 ℃范围内具有较好的稳定性;金属离子K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ca2+离子对酶反应无明显作用,Zn2+、Pb2+、Ni2+对酶反应有抑制作用。SDS-PAGE电泳结果表明酶蛋白的相对分子量约为66.7 kDa。反应动力学研究结果显示K_m值为65.63 mmol/L,V_max为2.03 mmol/(h·L)。通过对酶的催化特性研究表明,该酶能水解人参皂苷Rb3木糖基,生成人参皂苷Rd。     

产单宁酶海洋短梗霉的分离筛选及酶学性质的研究

单宁酶能水解单宁物质中的酯键,在食品和饲料工业中有重要应用价值。 该研究从海洋微生物中获得了几株高产单宁酶 菌株,其中菌株95水解圈与菌落（直径）大小的比值最大,对其进行生理生化鉴定,并扩增内转录间隔区（ITS）序列作进化树分析, 鉴定菌株95号为Aureobasidium subglaciale,其在发酵培养基中发酵72 h达到最大酶活力323.2 U/mL。 考察了温度和pH对酶促反应 影响,同时考察了粗酶的热稳定性和pH稳定性。 结果表明,菌株95号所产单宁酶最适反应温度为50 ℃,该酶在30 ℃、40 ℃、50 ℃水浴 保温4 h,相对酶活80%以上,具有较好的热稳定性;最适反应和最稳定pH均为6.0,在pH 3.0～7.0之间均有较高的酶活,表示其具有 较广的pH值稳定性。     

解淀粉芽孢杆菌I型耐热普鲁兰酶的纯化及酶特性分析

对来源于菌株解淀粉芽孢杆菌HxP-21的普鲁兰酶（命名为PulBa）分离纯化，研究其酶学特性，为普鲁兰酶在淀粉加工中的应用提供理论基础。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析从菌株HxP-21发酵液中分离纯化出一种新型的普鲁兰酶。酶的纯化倍数20.8，回收率53.2%，比活力176.5 U/mg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得PulBa达到电泳纯，分子质量51.2 kDa。PulBa在45～70 ℃和pH 3～6范围内具有较高酶活力，最适反应温度55 ℃、pH 4.5。PulBa有良好的pH值稳定性和热稳定性，40～70 ℃孵育120 min保留最初活性的80%以上；pH 3～7范围内具有很高的稳定性，孵育6 h后仍保留60 U/mL以上活性。PulBa对各种金属离子和化学试剂表现出不同的敏感性，Mg2＋和Ca2＋能够显著增强酶活力。PulBa最适作用底物为普鲁兰糖，对马铃薯支链淀粉、玉米支链淀粉、可溶性淀粉和糖原也有一定水解活性，但对α-环糊精和β-环糊精和直链淀粉无活性。以普鲁兰糖为底物PulBa的Km和Vmax值分别为1.34 mg/mL和24.6 μmol/（min·mg）。研究表明PulBa是典型的I型普鲁兰酶。薄层层析进一步证明，PulBa专一性水解支链淀粉α-1,6-糖苷键，产生麦芽三糖。本研究确定了一种新型的普鲁兰酶，该酶在高热稳定性和酸性环境下具有高活性，在淀粉加工等生物技术产业中有较好的应用潜力。     

CGTase合成γ-环糊精的酶促反应条件优化

采用筛选到的一株嗜碱芽孢杆菌,研究它所产生的环糊精糖基转移酶生产环糊精的工艺条件,重点探讨酶促反应条件对环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的影响。结果表明:环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的最佳工艺为反应体系的pH 8.0,温度60℃,环糊精糖基转移酶的酶量500U/g.淀粉,甘草酸浓度2%,淀粉的DE值6～11,在该条件下制备的产品得率最高;蕉藕淀粉和木薯淀粉在生产γ-环糊精时是环糊精糖基转移酶比较合适的底物;普鲁蓝酶对γ-环糊精的产量增加作用有限。     

新型耐热耐酸普鲁兰酶的分离纯化与酶学特性分析

从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF发酵液中分离纯化普鲁兰酶(PulXF)并研究其酶学性质。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析,纯化得到一种电泳纯的PulXF。纯化倍数8.16倍,比活力为309.28 U/mg。SDS-PAGE检测得单条带,表明PulXF为单亚基蛋白,分子量63.7 kDa。在50~80 ℃,pH4.5~8.0范围内,酶能保持高活性,最适反应温度60 ℃,最适pH5.0。在较广的pH范围内(pH3.0~8.0),28 ℃下,经过24 h酶活能保持80%以上活性。K_m值和V_max分别为0.92 mg/mL和11.90 μmol/min。酶活测定及TLC分析显示PulXF对普鲁兰多糖有强水解活性,终产物麦芽三糖;对支链淀粉和可溶性淀粉有较弱活性,对直链淀粉、α-环糊精、β-环糊精和糖原无活性。表明从泡盛曲霉XF分离的PulXF属于I型普鲁兰酶。Ca2+、Zn2+和Mg2+能够促进酶的活性,其中Ca2+激活作用最强。而PulXF在5%浓度的SDS、CTAB、Tween 80和30%的乙醇中保持高稳定性。基于PulXF在苛刻环境下的高稳定性及高活性,很有希望在淀粉加工、食品饮料等领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中使用。