中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05 α-淀粉酶基因的克隆和原核表达

本实验室从新疆盐湖分离得到一株产α-淀粉酶中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05,根据已报道的α-淀粉酶基因(α-AMY)序列的保守区域设计引物,从中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05基因组中扩增出α-淀粉酶基因片段,将α-淀粉酶基因纯化后克隆到pGM-T载体上测序,结果表明α-淀粉酶基因片段长约1500bp,与地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的α-淀粉酶基因序列的同源性为95%,两种序列具有一定的同源性。按正确的阅读框架将α-淀粉酶基因片段定向克隆到表达载体pET-32a上,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,α-淀粉酶基因能在大肠杆菌BL21中成功表达,确定表达蛋白的相对分子量为61kD左右,与理论推导的分子量相一致;构建的大肠杆菌工程菌,所产生的α-淀粉酶是包涵体,通过超声波粉碎仪粉碎后,测α-淀粉酶酶活为原菌的1.8倍。     

龙眼漆酶基因(DlLac)的克隆及表达分析

以‘石硖’龙眼为试材,采用RT-PCR结合RACE技术成功克隆一个龙眼漆酶基因全长c DNA序列,命名为Dl Lac,NCBI登录号为KY051551。Dl Lac基因序列全长1898 bp,编码576个氨基酸,NCBI比对结果显示其与荔枝漆酶氨基酸序列同源性最高,高达94%;进化树结果显示龙眼漆酶氨基酸序列与荔枝漆酶氨基酸序列具有高度同源性。氨基酸保守序列结果表明龙眼漆酶氨基酸序列含有漆酶的3个典型保守结构域,分别为:Cu-oxidase-3、Cu-oxidase和Cu-oxidase-2。结合龙眼果实在常温、低温贮藏条件下,果皮褐变与Dl Lac的表达关系,推测Dl Lac的上调表达可能对龙眼果皮褐变起促进作用。     

苦荞类异黄酮还原酶基因(FtIRL)的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到类异黄酮还原酶基因(IRL)的开放阅读框序列(ORF),命名为FtIRL。序列分析表明：FtIRL含一个长942bp的ORF,编码313个氨基酸,其氨基酸序列与金荞异黄酮还原酶FcIFR (GenBank登录号ABV02071)同源性最高,达到97%;与其他植物IRL同源性为44%～73%。生物信息学分析表明：FtIRL推导的蛋白质含有典型的底物结合口袋和保守的NADPH结合位点,符合短链脱氢酶家族的结构特征。构建基于氨基酸的系统发育树表明,苦荞FcIFR虽然在氨基酸序列上与其他植物的异黄酮还原酶(IFR)有较高的同源性,但其生物学功能可能更接近落叶松脂醇还原酶(PLR)。     

淀粉酶分解马铃薯淀粉的因素研究

研究α-淀粉酶与β-淀粉酶对马铃薯淀粉的分解效果。在控制一定温度和时间的条件下,采用正交设计、因素分析、优化处理、均衡试验。实验结果表明,α-淀粉酶添加量0.15%(4000U),淀粉量20%,处理温度80.0℃,时间13min,液化效果达到最佳;β-淀粉酶量0.15%(50000U)、温度60℃、时间46h、pH5.4,糖化效果最佳。     

烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

日照长度影响植物的生长发育,在拟南芥中CONSTANS是植物光周期开花途径中的关键基因。利用同源序列法结合RACE 技术从短日照烟草品种Kutsaga.Mammoth10 中分离出了开花时间相关的CO(CONSTANS)同源基因,并命名为NtCO1(基因登录号JN022535.1)。经序列分析,NtCO1 全长1493 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,81~1292 bp),编码403 个氨基酸;具有CO 蛋白典型的结构域;氨基末端有两个B-box 结构,羧基末端有CCT 保守结构域。氨基酸同源性比对发现,NtCO1 与茄科CO 同源蛋白一致性最高,同马铃薯CO 序列一致性达到86.5%;与拟南芥CO 蛋白和水稻Hd1 氨基酸序列一致性也分别达到50%和43.7%。基因表达分析表明,NtCO1在叶片中优势表达,茎中次之,根中最弱     

南方红豆杉GGPP合酶基因的克隆与生物信息学分析

根据GeneBank中公布的GGPPS基因保守区设计特异引物,克隆南方红豆杉GGPPS基因的DNA和cDNA序列,并通过生物信息学方法对其核苷酸序列和蛋白质结构进行分析预测。结果表明,GGPPS基因DNA和cDNA序列都为1 182 bp,DNA序列中无内含子,cDNA序列为一个编码393个氨基酸残基的开放式阅读框;GGPPS的理论相对分子质量为42 590,等电点为5.68。核苷酸同源性分析显示,它与Taxus canadensis(AF081514)同源性为98.8%;推导出的氨基酸序列与Taxus canadensis(AAD16018)同源性达99.0%。利用Protparam、SignalP、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling、Scan Prosite和MEGA4.0等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构、三级结构和进化树进行分析,为其功能研究和生物合成紫杉醇研究提供分子基础。     

大麦芽中淀粉酶系活力的测定及其作用特性

采用BPNPG7 法、PNP β-G3 法和普鲁兰法分别测定大麦芽中α- 淀粉酶、β- 淀粉酶和极限糊精酶活力,探讨温度和pH 值对大麦芽淀粉酶系活性的影响规律,并分析淀粉酶系的热稳定性及作用特性。结果表明：大麦芽中α- 淀粉酶、β- 淀粉酶和极限糊精酶的最适温度分别是70、60℃和55℃,最适pH 值分别为5.5、5.5 和5;α- 淀粉酶热稳定性相对较高;β- 淀粉酶在50℃和55℃时能保持良好的热稳定性;极限糊精酶热稳定性相对较差。α- 淀粉酶、β- 淀粉酶和极限糊精酶与水解体系还原糖含量有一定的关系。     

嗜水气单胞菌拮抗芽孢杆菌抗菌素相关基因分析

分别对抗鲟源嗜水气单胞菌的解淀粉芽孢杆菌G1的抗菌素相关基因进行PCR扩增与测序,并对其编码产物的氨基酸序列、跨膜螺旋信号、结构域与二级结构等进行预测与分析。结果表明:菌株G1仅含有伊枯草菌素合成必需基因,该基因与GenBank基因库中芽孢杆菌属其他细菌的伊枯草菌素A、杆菌抗霉素D、抗霉枯草菌素等伊枯草菌素家族基因自然聚类,与枯草芽孢杆菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素A基因16S rRNA序列有98%的高度同源性,而且其编码产物的氨基酸序列与GenBank中芽孢杆菌属其他细菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素A、脂肽类化合物Bacillorin、芽孢菌素D等抗菌物质的氨基酸序列有高度同源性,与枯草芽孢杆菌MH25的伊枯草菌素A合成酶B(GenBank登录号:ABY89499)的亲缘关系最近。此外,菌株G1伊枯草菌素合成必需基因的编码产物不具有明显的跨膜结构,但其结构域中存在AMP结合位点和PP结合位点,二级结构中存在α螺旋、伸展链、β转角和无规则卷曲。     

烟草脉带花叶病毒基因组序列分析

为了探明烟草脉带花叶病毒危害和流行的机制,使用RT-PCR技术扩增获得TVBMV云南分离物YN9.1基因组全序列,并进行了基因组结构、序列同源性、氨基酸保守基序、系统进化和重组分析。结果表明:(1)YN9.1基因组具有Potyvirus属病毒典型特征,含有在Potyvirus属病毒中较为少见的NIb/CP切割位点Q/N;(2)YN9.1与其它分离物核苷酸序列同源性为90.5-91.1%,氨基酸序列同源性为95.2-96.2%。与YND核苷酸和氨基酸序列同源性最高;(3)对HC-Pro和CP保守基序进行了分析。YN9.1具有RITC、PTK、DAG等病毒蚜虫传播保守基序,其中RITC在Potyvirus属病毒中常见形式为KITC;(4)系统进化树分析结果显示,TVBMV进化形成2个组,云南分离物独立进化形成一组,TVBMV进化与地域具有明显的相关性;(5)重组分析发现PY为ZC1和YN的组内重组体,重组位点位于HC-Pro 3'末端和NIb 5'端。      

米糠复合酶解工艺条件研究

以膨化米糠为主要原料,先经α-淀粉酶液化,再经糖化酶和蛋白酶同步酶解,改善米糠液中的营养成分。试验结果表明,α-淀粉酶水解最佳条件为酶用量1.5%,酶解温度为80 ℃,酶解时间为75 min,淀粉酶水解后还原糖含量达到0.657 1 g/100 mL。糖化酶和蛋白酶复合水解米糠,最适条件为pH4.5,糖化酶添加量0.2%,蛋白酶添加量2%,酶解温度60 ℃,酶解时间120 min,在此条件下,酶解液还原糖含量可达3.0 g/100 mL,氨基酸含量可达5.2 g/100 mL。     

紫甘薯饮料制备工艺研究

以紫甘薯为原料探讨紫甘薯饮料制备的工艺条件。比较α- 淀粉酶液化和高温液化两种方式对淀粉液化的效果,并进一步添加糖化酶进行淀粉糖化,同时探讨各工序对花色苷的影响,以饮料的可溶性固形物增长率、吸光度及色差值为考察指标。结果表明：鲜薯用两倍水打浆,加入0.020g/100mL α- 淀粉酶于70℃条件下酶解40min,再添加0.04g/100mL 的糖化酶在pH5.0 条件下糖化40min,既可获得理想的淀粉水解效果,又可尽量减少花色苷的损失。较好的饮料配方为30% 甘薯原汁、8% 蔗糖、0.05% 柠檬酸,其余为软水。采用该工艺条件可制备色香味俱佳的紫甘薯饮料。     

甜荞苯丙氨酸解氨酶基因PAL的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,首次从甜荞(Fagopyrum esculentum)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的cDNA ORF序列,命名为FePAL。该序列长2169bp,编码722个氨基酸,与其他植物PAL基因同源性较高,为80%～97%,其推导的氨基酸序列含有PAL酶活性中心特征序列GTITASGDLVPLSYIA和多个脱氨基、催化活性位点。系统发育树表明,甜荞PAL基因与苦荞PAL基因聚类关系最近。     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为有效调控烟草类胡萝卜素的合成代谢,从普通烟草中克隆到与植物类胡萝卜素合成代谢相关的β-胡萝卜素羟化酶基因BCH,以辣椒BCH基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码BCH基因的cDNA序列,暂命名为NtBCH1(GenBank登录号JQ410446)。NtBCH1包含一个完整的开放阅读框,编码309个氨基酸,具备脂肪酸羟化酶超家族保守结构域。序列比对结果表明,NtBCH1蛋白与其他植物的BCH蛋白具有很高的相似性。系统进化树分析表明,NtBCH1与番茄的亲缘关系最近。     

α-淀粉酶在不同地衣芽孢杆菌宿主菌中分泌表达的对比分析

研究不同地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主菌对α-淀粉酶分泌表达的影响。以Bacillus subtilis的P43启动子,B.licheniformis WX-02α-淀粉酶基因的信号肽、编码区和终止子序列为表达原件,构建了α-淀粉酶分泌表达载体pP43SAT。将pP43SAT分别转入3株B.licheniformis宿主菌:WX-02(ΔamyL)、BL9和BL10,获得3株α-淀粉酶基因工程菌WX-02(ΔamyL,pP43SAT)、BL9(pP43SAT)和BL10(pP43SAT),并将构建的3株工程菌进行发酵对比分析。BL9(pP43SAT)和BL10(pP43SAT)的淀粉酶发酵活力分别达到94.01 U/mL和101.94 U/mL,比原始宿主菌WX-02(ΔamyL,pP43SAT)分别提高了21%和31%,这说明BL9和BL10新型宿主菌有利于淀粉酶的分泌表达。本研究证明多蛋白酶基因缺失可显著提高α-淀粉酶的表达,为α-淀粉酶的高效表达提供了新型宿主菌和新策略。     

普通烟草抗渗透胁迫基因NtP5CS的克隆与表达分析

从普通烟草中克隆脯氨酸合成的关键酶基因P5CS,分析其序列特征、进化关系、表达模式,以期为烟草的抗逆研究奠定基础。设计兼并引物获得P5CS基因中间片段,利用RACE技术扩增其全长cDNA;采用生物信息学技术分析该基因的序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用RT-PCR研究其表达模式。从受干旱胁迫诱导的普通烟草品种中烟14中克隆到全长为2584bp的烟草P5CS基因,命名为NtP5CS,GenBank登录号为HM854026,开放读码框为2160 bp,编码719个氨基酸。经Blast同源性比对分析,该序列与番茄tomPRO2基因在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。系统进化树分析显示,NtP5CS与番茄tomPRO2基因可能是直系同源基因。RT-PCR分析表明,干旱、低温、ABA、高盐等胁迫条件均可诱导NtP5CS基因的上调表达,且在旺长期和胁迫条件下根和叶中表达量最高。首次从普通烟草中克隆得到P5CS基因,该基因对水分胁迫响应,可能参与普通烟草抗渗透胁迫反应。     

茉莉酸甲酯对烟草淀粉酶抑制剂诱导作用研究

研究了不同浓度的茉莉酸甲酯 ( MeJA)对烟草α-淀粉酶抑制剂诱导的时间及浓度效应,在斜纹夜蛾取食不同浓度的MeJA诱抗处理的烟草叶片1-3d后,对其中肠α-淀粉酶活性进行了检测。结果显示：0.01mmol/L、0.1mmol/L、1.0mmol/L、4.0 mmol/L和10.0mmol/L 5个梯度浓度的MeJA处理烟草后,烟叶中α-淀粉酶抑制剂含量明显增加,而4.0mmo1/L MeJA 诱抗处理48h时诱导烟草产生的α-淀粉酶抑制剂活性最强;离体检测结果表明斜纹夜蛾取食MeJA处理的烟草 叶片后,其中肠α-淀粉酶的活性降低。