盐酸西布曲明人工抗原的合成与鉴定

目的：建立盐酸西布曲明的免疫分析方法。方法：4-氯苯乙腈和1, 3-二溴丙烷为原料合成与盐酸西布曲明具有相同母核结构的小分子双去甲基西布曲明(M2),以双去甲基西布曲明为半抗原,并分别通过活泼酯法、戊二醛法和混合酸酐法将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫原(M2-BSA)和包被抗原(M2-OVA)。结果：紫外光谱扫描证明半抗原M2与载体蛋白偶联比为24.6:1(M2-BSA)和16.2:1(M2-OVA),抗血清ELISA效价均达到1:8000以上,IC50=0.42μg/mL。结论：半抗原M2与载体蛋白均已成功偶联,其中活泼酯法对半抗原活性基团的影响最小,合成人工抗原的特异性最强。     

泰拉霉素完全抗原的合成和鉴定

利用丁二酸酐法对泰拉霉素的羟基衍生化,引入游离羧基,合成泰拉霉素半抗原。采用活泼酯法将泰拉霉素半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联,合成人工完全抗原泰拉霉素-BSA和泰拉霉素-OVA。利用LC-MS鉴定衍生化后半抗原的合成,利用荧光光谱、考马斯亮法鉴定完全抗原的合成。用泰拉霉素-BSA免疫小鼠,采用间接ELISA法测定小鼠抗血清效价。泰拉霉素半抗原和BSA的偶联比为17∶1。三免后小鼠抗血清效价可达1∶8 000。     

氟西汀快速免疫检测用人工抗原的合成与鉴定

本文针对药物、减肥类保健食品中氟西汀成分及残留问题现状,主要研究了氟西汀人工抗原的合成方法,并对所合成的半抗原、人工抗原进行了结构和特异性鉴定。研究中先将氟西汀与丙烯酸甲酯反应后再经过水解制备出半抗原(H-FXT),再用活泼酯法将半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备了氟西汀人工免疫原(H-FXT-BSA)和氟西汀包被原(H-FXT-OVA),通过免疫原免疫Balb/c小鼠,利用间接ELISA方法对抗血清进行了鉴定评价。研究制备的人工抗原H-FXT-BSA、H-FXT-OVA经紫外光谱扫描计算后偶联比分别达到14.5:1和11.3:1。免疫小鼠后所获得抗血清的效价均达到30000以上,半抑制量浓度IC50值为100 ng/m L。本研究首次合成了鉴定氟西汀人工抗原,并成功获得了氟西汀抗体,本研究可为后期在药物、减肥类保健食品中氟西汀成分的免疫快速检测方法的建立和酶联免疫检测试剂盒等相关产品开发奠定了关键技术研究基础。     

黄曲霉毒素B1人工抗原及鼠源多克隆抗血清的制备

目的:研究合成并鉴定了黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源AFB1多克隆抗血清。方法:采用N-羟琥珀酰亚胺酯(N-hydroxy-succinimide NHS)法将AFB1分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原AFB1-BSA和包被抗原AFB1-OVA,采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行鉴定,通过动物免疫实验获得鼠源多抗血清,并使用间接ELISA和阻断ELISA的方法对多抗血清进行了鉴定。结果:结果表明半抗原AFB1分别和载体蛋白BSA及OVA偶联成功;免疫的6只小鼠效价均达1×10-4以上,3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50(50% inhibitive concentration,IC50)为8.199ng/mL。结论:实验成功合成了AFB1人工抗原,并生产了高效价、高敏感性的鼠源多克隆抗体血清,为AFB1单克隆抗体制备及其快速检测试剂的研制奠定了坚实的基础。     

罗丹明123人工抗原的合成及抗体的酶联免疫检测

为建立罗丹明B(rhodamine B)的免疫分析方法,采用戊二醛法,将半抗原罗丹明123与载体牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原R123-B S A和包被抗原R123-OVA。经动物免疫实验证实人工抗原合成,并制备抗罗丹明123的多克隆抗体,此抗体同时能够检测食品中的罗丹明B,且最低检测限为0.001ng/mL。     

质谱法测定4种真菌毒素与载体蛋白偶联物的结合比

采用基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOFMS)对由3种真菌毒素伏马菌素B1(FB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)与两种载体蛋白卵清白蛋白(OVA)、血清白蛋白(BSA)分别偶联制备得到的4种小分子-载体蛋白偶联物FB1-OVA、FB1-BSA、OTA-BSA、DON-OVA的偶联结合比进行测定,并与紫外吸收光谱法进行比较。基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱法测得偶联物FB1-OVA、FB1-BSA、OTA-BSA、DON-OVA的结合比分别为5:1、11:1、3:1、0;紫外吸收光谱法测得OTA-BSA的结合比为4.4:1,DON-OVA的结合比为3.4:1,无法测定FB1-OVA、FB1-BSA结合比。     

米诺环素完全抗原的制备与表征

研究制备能有效用于米诺环素(MNC)残留检测的完全抗原。采用戊二醛合成法和重氮化合成法,将米诺环素与牛血清白蛋白(BSA)偶联,分别制备MNC 完全抗原MNC-BSA。经红外和紫外光谱扫描结果表明：两种物质已经偶联,两种完全抗原的平均偶联比分别为9.9 和5.9。采用戊二醛法合成的完全抗原免疫兔,检测抗血清效价为1:16000,表明合成的完全抗原可以作为免疫原用于制备抗体及检测时的包被原进行ELISA 检测。     

伏马菌素B1人工抗原的制备及其鉴定

本试验采用戊二醛一步法将小分子半抗原(伏马菌素B1,FB1)与载体蛋白OVA进行偶联,制备人工抗原FB1-OVA。分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、紫外扫描法(UV)、质谱法(MS)和免疫芯片法来检测FB1与OVA的偶联效果。结果证明,成功得到了人工抗原FB1-OVA,而且通过质谱法检测得出FB1-OVA和OVA的分子量分别是51928.612和44265.718,分析其偶联比为10.6:1。     

三聚氰胺人工抗原化合物的合成及鉴定

目的：建立三聚氰胺残留的免疫分析方法。方法：以三聚氰胺结构类似物2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪为原料,分别与6-氨基己酸和对氨基苯甲酸,各经两步化学反应合成两种具有不同长度间隔臂的半抗原MEA和MEB,并分别通过碳二亚胺法和混合酸酐法将MEA和MEB与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备三聚氰胺的免疫原(MEA-BSA)和包被原(MEB-OVA)。结果：经质谱和紫外光谱表征,证明所合成的产物为目标半抗原MEA和MEB,并且与载体蛋白偶联比可达到25.28:1(MEA-BSA)和13.11:1(MEA-OVA)。结论：半抗原MEA和MEB及人工抗原合成成功。     

格列本脲人工抗原的合成与鉴定

目的：合成格列本脲人工抗原。方法：采用对氨基苯甲酸法制备半抗原,将半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)通过碳二亚胺法偶联制备免疫原(Gli-BSA)和包被原(Gli-OVA),利用紫外扫描进行抗原的化学鉴定,通过免疫原免疫Balb/c小鼠,间接酶联免疫吸附法测定抗血清进行生物鉴定。结果：制备了Gli-BSA、Gli-OVA的人工抗原,经紫外光谱扫描,偶联比分别为4:1和17.7:1。免疫小鼠后获得抗血清的效价均达到32000以上,半抑制质量浓度为10μg/mL。结论：成功合成了格列本脲人工抗原,并获得了格列本脲抗体,为格列本脲的免疫学检测方法进一步研究提供了实验基础。     

Development of a sensitive ELISA for the analysis of the organophosphorous insecticide fenthion in fruit samples

Two fenthion haptens, 4-(4-(dimethoxyphosphorothioyloxy)-2-methylphenylamino)-4-oxobutanoic acid (H1) and 6-(methoxy(4-(methylthio)phenoxy)phosphorothioylamino)hexanoic acid (H2), were synthesized. H1 was conjugated with bovine serum albumin (BSA) and H2 with ovalbumin (OVA) by the active ester method. Then H2-OVA conjugate was used as coating antigen, while H2-BSA conjugate was used to produce polyclonal antibodies. After optimization, an effective competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of fenthion was established with the new combination of antibody/antigen, I₅₀ of which was 0.01 ng/ml, and there was only cross reactivity (CR) with fenitrothion (4.5%), and CRs with other tested pesticides were all below 0.1%. The recoveries obtained by standard fenthion addition to the different fruit samples such as grape, peach, pear and tomato were all from 79.8% to 106.0%. Therefore, the optimized ELISA may become a new convenient and satisfied analytical tool for monitoring fenthion residues in agricultural samples.     

重金属铅多克隆抗体的制备及鉴定

目的：合成铅离子完全抗原,并对其进行鉴定;用合成的完全抗原免疫Balb/c 小鼠制备多克隆抗体,鉴定效价和特异性。方法：用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA 将Pb2+ 与载体蛋白BSA 和OVA 偶联在一起,合成免疫抗原(Pb-DTPA-BSA)和检测抗原(Pb-DTPA-OVA),并通过SDS-PAGE、紫外扫描、电感耦合等离子体(ICP) 检测抗原中Pb2+ 含量,以及通过免疫Balb/c 小鼠,采集血清进行间接ELISA 和竞争ELISA 检测。结果：两种合成的抗原相对于各自的载体蛋白均出现了蛋白条带滞后,紫外吸收峰偏移等现象;免疫的4 号和5 号Balb/c 小鼠的抗血清效价达1:400000;与OVA 无交叉反应,ELISA 检测IC50 值为1.5ng/mL,与Fe3+ 有近5% 的交叉反应,与其他重金属离子的交叉反应均小于1%。结论：铅离子多克隆抗体制备成功。     

抗AFB_1单域重链抗体文库淘选方法的研究

比较两种从噬菌体展示文库中淘选抗黄曲霉毒素B1单域重链抗体的方法,并为淘选针对小分子物质的单域重链抗体提供参考.采用固相淘选技术,以黄曲霉毒素B1人工抗原为靶分子,淘选天然单域重链抗体库,分别采用Gly-HCl法和AFB1竞争法洗脱结合噬菌体,对洗脱物进行滴度测定,以回收率和富集度为指标,对两种洗脱方法进行比较.采用phage-ELISA法鉴定噬菌体克隆,并对阳性克隆进行交叉反应分析以及序列测定.滴度测定结果显示,Gly-HCl法回收率比竞争法高5～10倍.分别随机挑取20个单克隆进行phage-ELISA鉴定,其中,Gly-HCl洗脱法未获得阳性克隆,AFB1竞争洗脱法得到8个阳性克隆.序列测定结果显示,这8个克隆均编码单域重链抗体.     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

环丙沙星人工抗原的合成及鉴定

通过化学方法制备了环丙沙星的免疫抗原和包被抗原;分别采用碳二亚胺(EDC)法和氯甲酸乙丁酯法把环丙沙星与BSA进行了偶联制备了人工免疫抗原CIP-BSA,EDC法制备了包被抗原CIP-OVA,经PAGE、紫外分光光度法测定了人工合成抗原的偶联比,EDC法和氟甲酸乙丁酯法制得的CIP-BSA两分子结合比率分别为4:1和11:1,CIP-OVA中两分子结合比率为12:1.这为环丙沙星单克隆抗体的制备奠定了基础.