李斯特菌噬菌体的分离鉴定及其裂解特性

以单核细胞增生性李斯特菌(Lm)为宿主菌,从畜禽养殖区污水中分离(Lm)特异的噬菌体,分析其生物学特性、裂解特性及其在食品中的灭菌效果。用双层平板法从污水样中分离Lm噬菌体,PEG/NaCl法沉淀纯化噬菌体,负染色后电镜观察。分析噬菌体对宿主菌的裂解特性及其对温度和pH值的敏感性,同时对该噬菌体进行宿主谱系分析。将噬菌体运用于即食性食品中,分析其潜在的灭菌效果。结果表明:分离的噬菌体为裂解性噬菌体,属长尾噬菌体科,命名为LipG2-5。体外能够高效裂解宿主菌,对温度及pH值亦有良好的耐受性。基因组酶切分析表明,LipG2-5为双链DNA噬菌体。噬菌体谱系分析表明,该噬菌体为1株宽宿谱噬菌体,在固态及液态即食性食品中能够高效杀灭Lm。     

4种分离培养基检测志贺氏菌效果比较

志贺氏菌是一类具有高度传染性的肠道致病菌。文中基于GB 4789.5—2012《志贺氏菌检验》标准,比较了4种分离培养基检测志贺氏菌的效果。通过4种分离培养基对福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌的回收率、最低检出限及对不同样品检测效果的比较,对不同培养基的检测效果进行评价。结果显示4种分离培养基最低检出限相近,显色培养基01检测特异性优于其他3种;针对实际检测样品,应灵活选择培养条件,以提高检测的准确性及效率。     

志贺氏菌噬菌体空间杀菌效力的研究

将福氏志贺氏菌噬菌体SF-2A、痢疾志贺氏菌噬菌体SD-11及宋氏志贺氏菌噬菌体SS-92以等比例混合后进行气雾喷洒分析其在空间的杀菌效力,以期在食品生产和加工中控制食源性志贺氏菌的污染。首先在空间分析不同噬菌体气雾喷洒后的杀菌活性和最佳作用浓度,其次将福氏、痢疾及宋氏志贺氏菌以等量进行混合,以3×105cfu/mL的终浓度进行人工喷洒污染,并以3×108cfu/mL的噬菌体混合物进行气雾喷洒,分别在喷洒后1 h,2 h和3 h检测宿主菌的数量。结果显示,噬菌体SF-2A、SD-11及SS-92均能在空间有效灭活其相应宿主菌,其混合溶液作用3 h后已检测不到志贺氏菌。由此可见,混合噬菌体能够有效控制志贺氏菌的污染,这为食品生产及加工中环境中的病原菌的污染控制提供了新途径。     

量子点免疫标记法检测福氏志贺氏菌

研究基于抗原抗体反应捕获目标菌,结合生物素与亲和素间的特异性相互作用,联合免疫纳米磁珠磁性分离、免疫量子点荧光标记技术,运用荧光检测系统,建立了福氏志贺氏菌的定量检测模型。结果表明,福氏志贺氏菌菌浓度为102CFU/mL~105CFU/mL,相对荧光强度与菌浓度关系为FI=12.78lgN+15.941,呈良好的线性关系,决定系数R2=0.9761。进一步对模型的准确度和精确度进行验证,得到菌落浓度预测值与真实值差异小,检测相对标准偏差为1.8%,表明模型的准确度好,精密度高。该方法可简单、快速（2h）、高效地检测福氏志贺氏菌。     

抗痢疾志贺氏菌的特异性IgY的研究

以痢疾志贺氏菌为抗原免疫产蛋母鸡,从鸡卵黄中提取免疫球蛋白,建立抗痢疾志贺氏菌的特异性IgY的效价检测方法,并研究母鸡的免疫应答性以及抗体的提取方法和体外抑菌效果。研究结果表明:用108cfu/mL和109cfu/mL剂量的抗原分别免疫的鸡的卵黄中,于初次免疫后的第12天出现抗痢疾志贺氏菌IgY,两组效价均为1∶3600。经加强免疫后效价迅速上升,至第48天低剂量免疫组达到最高效价1∶28800;第60天高剂量免疫组达到最高效价1∶57600。低剂量免疫组的效价维持了210d,高剂量免疫组的效价在免疫后360d时仍维持在1∶7200水平。用水稀释法、硫酸铵溶液分级盐析、SephadexG-25凝胶过滤以提取IgY,提纯后IgY的效价翻倍。SDS-PAGE鉴定抗体的纯度,电泳图谱中出现抗体的轻链和重链两条带。体外抑菌实验表明,IgY能抑制痢疾志贺氏菌的生长。     

双抗夹心ELISA快速检测冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a

为建立冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a双抗夹心ELISA检测体系,采用福氏志贺氏菌2a抗原免疫获得多克隆抗体,应用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选出1株福氏志贺氏菌2a单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为2C10。试验结果表明,2C10杂交瘤细胞株抗体效价为1∶10.24×104,抗体纯度为96%,免疫球蛋白亚型为IgG2a。用此单克隆抗体作为检测抗体,多克隆抗体为捕捉抗体,建立双抗夹心ELISA体系,检测限为1 000 CFU/g。用此体系检测宋内志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌及阪崎肠杆菌,均无交叉反应。本研究可为冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a的检测提供一种特异性强,准确度高的ELISA检测方法。     

沼气发酵对痢疾志贺氏菌的致死效应研究

在10L发酵瓶中探索沼气发酵温度和猪粪添加量对沼气发酵杀灭痢疾志贺氏菌的影响。结果发现在所研究的各种温度和各种猪粪添加量下的沼气发酵对痢疾志贺氏菌的杀灭都有很好效果,其中35℃下猪粪固形物为10%时的沼气发酵达到最好的杀灭痢疾志贺氏菌效果,当发酵时间超过36 h时,痢疾志贺氏菌的死亡率达到99%以上。     

基于免疫纳米磁珠对福氏志贺氏菌的快速富集研究

利用纳米磁珠的超顺磁性,结合传统平板计数的方法,通过捕获效率,研究免疫纳米磁珠制备过程中抗体加入量以及免疫纳米磁珠捕获目标细菌时的加入量,并利用免疫纳米磁珠对纯菌液以及羊肉洗水中100、101、102、103CFU/mL的福氏志贺氏菌进行捕获。结果表明,志贺氏菌多克隆抗体(4～5mg/mL)结合1mL链酶亲和素纳米磁珠((180±20)nm,2mg/mL)的最佳量为70μL,免疫纳米磁珠捕获高浓度目标细菌(102～104CFU/mL)时的最佳加入量为60μL。对于纯菌液和羊肉洗水,其捕获限可分别达到100CFU/mL和101CFU/mL,并且捕获时间在1h之内。本研究优化了实验条件,为免疫磁珠快速富集目标菌提供了理论依据。      

沙门氏菌裂解性噬菌体的分离鉴定及其生物学特性

从家禽屠宰场污水中,以肠炎沙门氏菌ATCC13076和禽沙门氏菌CVCC2184为宿主菌,分离到两株裂解性沙门氏菌噬菌体,分别命名为vB_SenM-PA13076（简称PA13076）和vB_SenM-PC2184（简称PC2184）。同时对这两株噬菌体进行了噬菌斑、噬菌谱系（含耐药菌）、形态学（透射电镜）、遗传物质、酸碱及热稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线等生物学特性研究。结果表明：两株噬菌体的裂解空斑均透亮清晰;除对本身宿主菌产生强裂解作用,还裂解其他沙门氏菌,为宽噬菌谱,其中PA13076能强裂解一株耐氨苄青霉素ATCC13076转化菌株（A+13076）,PC2184则能裂解另一株耐氨苄青霉素CVCC2184转化菌株（A+2184）;电镜观察这两株噬菌体均为肌尾病毒科;遗传物质为dsDNA;pH值和温度耐受能力较好;PA13076、PC2184最佳感染复数分别为0.01、10,潜伏期分别为20、30 min,爆发期分别为70、60 min,平均爆发量分别为21、23。     

温度、pH值、盐度交互作用优化福氏志贺氏菌F2b培养条件

研究温度、pH值、盐度3个因素交互作用下食源性致病微生物福氏志贺氏菌F2b的最优培养条件.在温度、pH值、盐度单因素试验的基础上,应用 Box-Behnken中心组合试验原理,设计三因素交互作用试验.以温度、pH值、盐度为响应因子,以菌液的OD550为响应值,采用响应面法处理试验数据.结果表明,在所选的因素水平范围内,温度、pH值对F2b生长影响显著,温度、pH值之间交互作用显著.获得志贺氏菌F2b的最佳生长条件为温度35.8 ℃,pH值7.7,盐度0.76 g/dL.经过验证,实测值和预测值之间偏差为1.1%,表明响应面法优化F2b培养条件真实、快速、有效.     

烈性噬菌体vB_VpP_AC2的分离鉴定及生物学特性分析

该研究从水产市场污水中分离纯化副溶血性弧菌噬菌体,并对其中一株噬菌体vB_VpP_AC2（AC2）进行分离鉴定、基因组及部分生物学特性分析,探究该噬菌体作为副溶血性弧菌生防制剂的潜力。噬菌体AC2的噬菌斑透明且边缘清晰,透明部分的直径约为1.12 mm,无可见晕圈。噬菌体AC2的全基因组序列长44 270 bp,鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量为49.30%,共预测到55个假定的开放阅读框,其中37个与编码已知功能蛋白质的基因相似（占67.27%）,包括一个类似holin功能的蛋白（AC2_gp43,UTQ72417.1）,该功能蛋白首次在Maculvirus属中被表征。经蛋白网络与末端酶系统发育树分析鉴定,噬菌体AC2属于自转录病毒科（Autograohiviridae）,Maculvirus属,与噬菌体vB_VpaP_MGD1的ANIb值最高,为95.62%。在生物学特性方面,噬菌体AC2能够裂解30.77%的受测菌株,其最佳感染复数为0.001~0.1,一步生长曲线显示AC2的潜伏期为20 min,裂解期为35 min,裂解量为143 pfu/cell。总之,噬菌体AC2的分离鉴定不仅可为相关功能蛋白的研究提供参考,还可为水产食品安全提供较高应用价值的噬菌体资源。     

1 株裂解性短尾沙门氏菌噬菌体T139的生物学特性及其对牛奶和牛肉的抑菌作用

采用双层平板的方法以鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 13311）为宿主菌,从污水中分离得到1 株裂解性噬菌体,命名为T139,研究其生物学特性及其在牛奶和牛肉样品中的抑菌作用。结果表明：噬菌体T139的噬菌斑透亮清晰;能裂解宿主菌及其他沙门氏菌,为宽宿主谱;电镜观察噬菌体T139属于短尾噬菌体科,头部直径为（43±1）nm,尾部长（11±0.6）nm;最佳感染复数（multiplicity of infection,MOI）为0.001;最佳吸附速率为66%;一步生长曲线结果显示潜伏期为5?min,爆发期为60?min,平均裂解量为54.54?PFU/cell;在30～50?℃和pH?4～12条件下稳定且对体外培养的鼠伤寒沙门氏菌有良好的裂解效果。噬菌体T139对牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果为：在4?℃无显著效果,在25?℃条件下MOI=10和MOI=100时抑菌效果极其显著,宿主菌数量分别下降4.32（lg（CFU/mL））和4.27（lg（CFU/mL））;噬菌体T139对牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果为：在4?℃条件下,MOI=10时无显著效果,在MOI=100时宿主菌数量下降0.66（lg（CFU/mL））,在25?℃条件下MOI=10和MOI=100时宿主菌数量分别下降了0.77（lg（CFU/mL））和1.16（lg（CFU/mL））,表明噬菌体T139对牛奶和牛肉中鼠伤寒沙门氏菌有良好抑制作用。     

1 株金黄色葡萄球菌烈性噬菌体的生物学特性及其裂解效果

以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）为宿主菌从奶牛养殖场污水中分离到1 株烈性噬菌体P65。透射电镜表明,噬菌体P65头部呈多面体结构,属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科。噬菌体P65最佳感染复数为0.01,一步生长曲线显示,噬菌体P65潜伏期为10 min,裂解周期为90 min,裂解量为35.46 PFU/cell。在pH 4～10和温度30～45 ℃条件下具有稳定的裂解活性。紫外线照射70 min后,噬菌体P65效价由1.91×108 PFU/mL降至2.65×104 PFU/mL。经噬菌体处理48 h后,菌株MRSA 2和MRSA 24的生物被膜清除率分别为91.3%和92.2%。在25 ℃条件下,噬菌体P65在牛奶和牛肉细菌污染模型中有一定的抑菌效果。本研究表明噬菌体P65具有较宽的宿主谱和稳定的裂解杀菌能力,在清除生物被膜和食品抗菌方面有一定的运用潜能。     

噬菌体vB_SauM_RS对乳源金黄色葡萄球菌生物被膜的清除作用

目的:以金黄色葡萄球菌为宿主菌,分离裂解性噬菌体vB_SauM_RS,测定其生物学特性,并探究其在两种牛奶中的抑菌效果及对生物被膜的清除作用.方法:将噬菌体与金黄色葡萄球菌以1∶100的比例(菌体数量比)分别接种于脱脂牛奶和全脂牛奶中,分别在4℃和25 ℃环境下处理,测定不同时间脱脂牛奶和全脂牛奶中细菌浓度和噬菌体效价...     

Evaluation of culture media for enrichment and isolation of Shigella sonnei and S. flexneri

The performance of Gram-negative (GN) broth with (10 μg/ml) and without novobiocin, Shigella broth (SB) with 0.5 and 3.0 μg/ml novobiocin, all incubated at 37 °C (SB with 3.0 μg/ml novobiocin also at 42 °C) and buffered brilliant green bile glucose (EE) broth with 1.0 μg/ml novobiocin incubated at 37 and 42 °C were evaluated for resuscitation and growth of Shigella sonnei and S. flexneri (eight strains; unstressed, chill-stressed and acid-stressed) and non-shigellae (11 strains). GN broth with or without novobiocin supported significantly less growth of Shigella sp. No significant differences in growth of shigellae were obtained between the other culture media. Performance depended more on the Shigella strain used. None of the tested media were significantly superior for suppressing the competitive flora.

Electivity and selectivity of MacConkey agar (MAC), tergitol-7 agar (T7), desoxycholate citrate agar (DCA), xylose lysine desoxycholate agar (XLD), Salmonella Shigella agar and Hektoen enteric agar (HEA) were determined by ecometric testing. HEA confirmed to be a high selective medium for both non-shigellae and stressed Shigella sp. Klebsiella sp., Enterobacter sp., Citrobacter sp., Salmonella sp. and the Escherichia strains can mask the presence of shigellae.

In vitro competition experiments and experiments with artificially contaminated foods showed higher resistance of S. sonnei than S. flexneri towards the stress imposed by the food matrix and its indigenous flora. Reliable detection, however, of shigellae in foods with the current enrichment and isolation media was not achieved.     

牛奶样品中志贺氏菌胶体金免疫试纸条检测方法的建立

通过用超声波破碎的宋内氏志贺氏菌和福氏志贺氏菌的菌体碎片为免疫原免疫BALB/c小鼠,获得4株能稳定分泌抗志贺氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选取其中一株制备单抗,并用胶体金标记。同时抗志贺氏菌的兔多抗和驴抗鼠抗体(二抗)分别喷涂于硝酸纤维素膜作为检测线(T线)和质控线(C线),研制了志贺氏菌胶体金快速检测试纸条。结果显示试纸条的灵敏度为105mL-1,并只与两株志贺氏菌有阳性反应外,而与其它23株常见的细菌无交叉反应。同时在检测添加有阪崎肠杆菌和长双歧杆菌的牛奶样品中,结果显示试纸条的灵敏度为106mL-1。志贺氏菌免疫胶体金试纸条的建立,为加强食品中志贺氏菌的检测工作,建立一种快速、简便的筛查方法具有重要的意义。     

杀菌条件对羊乳品质特性及储藏稳定性的影响

本研究通过不同条件(65℃、30 min,75℃、20 min,85℃、15 min,90℃、10 min)对羊乳进行杀菌处理,主要利用色差仪、电子鼻分析、高效气相色谱检测及超高分辨显微镜分别对羊乳色度及外观状态、风味、中-短链游离脂肪酸含量等进行测定,并探究21 d贮藏期内羊乳的平均粒径与微观结构的变化。结果表明,不同杀菌条件对羊乳色度及外观状态无显著影响(P>0.05),电子鼻检测可明显区分不同杀菌条件下羊乳的风味变化,杀菌后乳中-短链游离脂肪酸含量均显著增加(P<0.05)。经21 d储藏后,羊乳粒径增大导致体系稳定性降低,90℃、10 min杀菌条件可有效抑制羊乳贮藏期内粒径的增加,有利于提高羊乳稳定性,为增强羊乳品质特性并改善其加工工艺提供理论依据。