L-缬氨酸发酵影响因素的研究

以黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）XV0505为生产菌株，研究了发酵培养基和发酵控制条件对L-缬氨酸的产量和糖酸转化率的影响。应用单因素实验确定发酵的工艺条件，利用纸层析-色班洗脱比色法测定发酵液中L-缬氨酸含量。在最优发酵条件下，通过10L罐流加发酵72h，产酸可达53．4s／L．糖酸转化率为26．7％，分别比补料分批发酵提高1l-9％和3．5％。     

L—缬氨酸发酵中试的研究

采用黄色短杆菌Ｌ－缬氨酸产生菌ＺＱ－２，进行５００Ｌ发酵罐Ｌ－缬氨酸发酵中试，在以工业糖，硫酸铵为主要原料的培养基中进行一次中糖发酵可产３．５％以上的Ｌ－缬氨酸，最高达到３．９１％，属国内领先水平。     

产L-亮氨酸营养缺陷型突变株黄色短杆菌

氨基酸是构成蛋白质的基本单位,是生物体内不可缺少的营养成分,L-亮氨酸是人体8种必需氨基酸之一,也是三种支链氨基酸之一,在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有重要的用途.以一株黄色短杆菌为出发菌株,经紫外线、盐酸羟胺和硫酸二乙酯等多次诱变处理,单菌落分离、摇瓶初筛和摇瓶复筛,获得了一株蛋氨酸和异亮氨酸双重缺陷型突变株SFL8-3(Met-,Ile-),摇瓶发酵L-亮氨酸产量达18.98g/L.     

L-缬氨酸摇瓶发酵条件的研究

通过对选育出的L-缬氨酸高产菌XH-378（Brevibacterium flavum,Leu^-＋a-AB′＋AHV′）的摇瓶发酵条件的研究,试验结果表明：发酵培养基中葡萄糖、玉米浆和生物素的最适用量分别为15％、0．8％和20mg／100mL,32℃发酵培养72小时,L-缬氨酸积累可达58g／L。     

乳糖发酵短杆菌lysC突变对L-赖氨酸积累的影响

从一株乳糖发酵短杆菌L-异亮氨酸生产菌中克隆出天冬氨酸激酶AK-1的编码基因ly-sC1,经DNA测序并与来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的野生型lysC比对发现其中有2个核苷酸1186G和1187C缺失,造成翻译提前终止。AK-1还有下列2个有效突变位点:Ala 279 Thr和Ser317 Ala。lysC1在大肠杆菌BL21中的诱导表达量约为lysC的1/4,其表观比酶活也较低,但对L-苏氨酸和L-赖氨酸协同反馈抑制不敏感。用大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭表达载体pDXW-8将ly-sC1在野生型乳糖发酵短杆菌ATCC13869中诱导型表达,经摇瓶发酵积累L-赖氨酸7.4 g/L,在3 L发酵罐上达40 g/L。     

黄色短杆菌生产L-精氨酸发酵条件的优化

通过单因子实验对产L-精氨酸黄色短杆菌发酵生产L-精氨酸的培养基组成及培养条件进行了研究,得到了优化后的发酵条件,在20L发酵罐上产酸率可达65g·L^-1,糖酸转化率达35％。     

黄色短杆菌YILW生产L-异亮氨酸的发酵工艺研究

本文对L-异亮氨酸产生菌YILW的发酵工艺条件做了研究,确定了其积累L-异亮氨酸的较为适宜的条件。分别研究并确定了其发酵时的最适接种量、最适宜供氧条件、发酵最适温度、最适pH以及最佳菌体浓度等条件。在此条件下,在5L发酵罐上发酵60h,L-异亮氨酸产量达到29.6g/L,糖酸转化率达到21%。     

黄色短杆菌产L-苏氨酸的中试发酵工艺研究

对黄色短杆菌在发酵罐中产苏氨酸的发酵工艺进行研究.通过单因素试验确定了培养时间、温度、pH和接种量的最优条件.在单因素试验的基础上,利用正交试验确定发酵最优条件.结果证明:在最优试验条件下(温度30℃,pH 7,接种量10％),L-苏氨酸产率为12.14％.     

产L-亮氨酸营养缺陷型突变株黄色短杆菌SFL8-3的选育

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是生物体内不可缺少的营养成分，L-亮氨酸是人体8种必需氨基酸之一，也是三种支链氨基酸之一，在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有重要的用途。以一株黄色短杆菌为出发菌株，经紫外线、盐酸羟胺和硫酸二乙酯等多次诱变处理，单菌落分离、摇瓶初筛和摇瓶复筛，获得了一株蛋氨酸和异亮氨酸双重缺陷型突变株SFL8-3（Met^-，Ile^-），摇瓶发酵L-亮氨酸产量达18．98g／L。     

L-缬氨酸高产菌诱变育种的研究

以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)L-缬氨酸产生菌XQ-2为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)逐级诱变处理,氨基酸结构类似物α-氨基丁酸(-αAB)、2-噻唑丙氨酸(2-TA)和α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)定向筛选,获得一株L-缬氨酸高产菌XQ-8(Leul(-ABhr2-TAhrAHVhr)。在以135 g/L葡萄糖为碳源和50 g/L硫酸铵为氮源的培养基中摇瓶发酵72 h,产酸达64~66 g/L。     

氮源及其补加策略对L-缬氨酸发酵的影响

通过分析黄色短杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸的过程,得知在菌体生长期和快速产酸期氮源对L-缬氨酸发酵的影响不同。以黄色短杆菌XV0505为供试菌株,研究了不同氮源种类及不同氮源浓度对L-缬氨酸发酵过程的影响,选定了以豆饼水解液和硫酸铵为氮源,并确定了合适的初始氮源浓度。在初始氮源浓度相同的情况下,考察了间歇流加补氮策略、恒氮源浓度补氮策略和幂函数流加补氮策略对L-缬氨酸发酵的影响,研究发现,幂指数补氮策略可减少频繁的取样及铵浓度检测,在缺乏在线监测系统和反馈自控系统的情况下,将发酵体系中氮源浓度维持在合适值,既可适度促进菌体生长,又可使L-缬氨酸的产量得到进一步提高。在最优的氮源添加策略下,在30 L发酵罐发酵60 h,发酵液中L-缬氨酸可达63.17 g/L,糖酸转化率24.69%。     

黄色短杆菌原生质体制备与再生条件的研究

目的 研究高产谷氨酰胺的黄色短杆菌原生质体制备和再生的最佳条件.方法 用青霉素和甘氨酸预处理黄色短杆菌后,用溶菌酶酶解,研究菌龄、青霉素和甘氨酸预处理浓度及时间、酶浓度、酶解时间、酶解温度等条件对原生质体制备和再生的影响.结果 原生质体制备和再生的最佳条件为:预处理处于对数生长早期的黄色短杆菌,青霉素最适浓度0.4 u/mL,甘氨酸浓度2％,预处理时间2h,酶浓度1 mg/mL,酶解时间12h,酶解温度37℃.结论 在最佳条件下原生质体形成率达99.71％,再生率达16.52％.     

营养及环境条件对黄色短杆菌WL-10发酵生产L-异亮氨酸的影响

研究了能积累 L 异亮氨酸的黄色短杆菌WL 10的菌体生长规律 ,并讨论了葡萄糖、玉米浆以及磷酸盐等几个主要的营养物质对其积累L 异亮氨酸的影响 ,确定了较优的发酵条件为 :葡萄糖 12 % ,(NH4) 2 SO42 % ,玉米浆 2 % ,KH2 PO40 1% ,MgSO40 0 5 % ,CaCO33% ,种龄 9h ,接种量为 6 %。在此条件下 72h摇瓶产酸可达 2 3%左右。在上述基础上 ,研究了不同温度对WL 10积累L 异亮氨酸的影响 ,提出了分阶段变温控制的操作模式 ,即 0～2 5h ,培养温度为 31℃ ,2 5h后将温度降为 2 8℃ ,采用 5L罐实验 6 0h可积累L 异亮氨酸2 5 %。     

葡萄糖流加方式对黄色短杆菌生产L-亮氨酸的影响

利用30 L发酵罐,研究了黄色短杆菌TK0303生产L-亮氨酸的发酵工艺。考察了初始葡萄糖浓度和发酵过程中3种补料策略(分批间歇流加补料、恒葡萄糖浓度流加补料和DO-在线识别流加补料)对菌体生物量、L-亮氨酸产量、副产物含量及糖酸转化率的影响。最终确定:分批补料发酵的初始葡萄糖浓度为60 g/L,葡萄糖补加采用DO-在线识别流加方式。根据溶氧响应信号的特征反馈控制葡萄糖的流加速率,可实现葡萄糖的限制培养,有效减少了发酵副产物的含量,菌体生物量和L-亮氨酸产量得到显著提高,分别为21.8 g/L和41.3 g/L,且糖酸转化率高达22.4%。     

基于代谢流量分析的黄色短杆菌TK0303合成L-亮氨酸发酵过程的优化

测定并计算了在发酵中后期L-亮氨酸等代谢物的胞外浓度和积累(或消耗)的速率。应用代谢流分析方法,通过MATLAB软件线性规划得到发酵中后期胞内代谢流分布及L-亮氨酸合成的理想代谢流分布。结果表明,在L-亮氨酸分批发酵过程中,有98.73%的葡萄糖进入糖酵解途径,仅1.27%进入HMP途径,55.10%的碳架进入TCA循环,25.21%用于合成L-亮氨酸。实验测定的合成L-亮氨酸的代谢流远低于理想代谢流(66.67)。根据代谢流分析结论,文中通过优化发酵过程控制如流加方式、溶氧水平等方面来减少副产物的生成,控制TCA循环代谢流,从而提高L-亮氨酸的产率。实验采用脉冲补料方式,控制溶氧浓度在20%左右,L-亮氨酸最高产酸达到38g/L。     

L－缬氨酸菌种选育

以硫酸二乙酯（ＤＥＳ）诱变处理黄色短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＸＱ５１２２，得到突变株Ｖ３－３６＜Ｌｅｕ￣１、α－ＡＢ￣ｒ、ＡＨＶ￣ｒ），在１０％葡萄糖培养基中可积累２．３％Ｌ－缬氨酸。以亚硝基胍（ＮＴＧ）诱变Ｖ４－１５３，得到一株突变株（Ｌｅｕ￣１、α－ＡＢ￣ｒ、ＡＨＶ￣ｒ、２－ＴＡ￣ｒ），再进行单菌落分离，得到突变株ＺＱ－２，能在培养基中积累Ｌ－缬氨酸４．２％～４．５％，最高达５．５７％．     

L-缬氨酸高产菌XQ-8补料分批发酵的研究

在分批发酵优化条件基础上,通过对补料分批发酵方式发酵过程的各种参数,包括产酸率、转化率和发酵周期等进行了研究,确定了L-缬氨酸高产菌XQ-8补料分批发酵的最优条件。在最优补料分批发酵条件下发酵72h左右,L-缬氨酸产量达72g/L,糖酸转化率达38%以上,其结果明显优于分批培养。     

黄色短杆菌ilvBN和ilvC基因定点突变对L-缬氨酸发酵的影响

以黄色短杆菌MH-1000为出发菌株,使用PCR技术克隆ilvBN与ilvC基因,对ilvBN进行定点突变,获得解除L-缬氨酸对乙酰羟酸合酶反馈抑制突变型基因ilvBN′.对基因ilvC进行点突变,获得乙酰羟酸变位酶突变基因ilvC′.通过重叠延伸PCR方法,将基因片段ilvBN′和ilvC′拼接为ilvBN′C′,进而连接至穿梭载体pXMJ19获得重组质粒pXMJ19-ilvBN′C′.该重组质粒转化至出发菌株获得工程菌株MH-1032.50L分批补料发酵结果显示:MH-1000发酵72hL-缬氨酸质量浓度为35.2g/L,MH-1032发酵72 h L-缬氨酸质量浓度为38.4 g/L,增长9.1%,糖酸转化率从21.7%提高到25.8%.     

原生质体融合选育L-亮氨酸高产菌的研究

以黄色短杆菌TQ5 35 1(Met- +Ile- + 2 TAr+SGr)和TQ5 35 6(Met- +Ile- +α ABr+ β HLr)为亲株 ,采用原生质体融合技术 ,定向选育出一株L 亮氨酸高产菌TQ980 6(Met- +IleL + 2 TAr+SGr+α ABr+ β HLr) ,该菌株经 5L罐分批发酵 64h产L 亮氨酸2 2 7g/L。