L-亮氨酸生物合成关键酶基因的克隆和表达

通过PCR获得黄色短杆菌ATCC14067基因组上编码L-亮氨酸合成途径中关键酶的基因.连接大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达质粒pDXW-8构建多种重组质粒,分别转化模式菌株C.glutamicum ATCC13032考察对其发酵生产L-亮氨酸的影响.经摇瓶发酵实验显示:C.glutamicum ATCC13032发酵液中没有L-亮氨酸的积累而基因工程菌ATCC13032/pDXW-8-leuA-ilvBNC中L-亮氨酸的产量达4.75g/L.     

黄色短杆菌ilvBN和ilvC基因定点突变对L-缬氨酸发酵的影响

以黄色短杆菌MH-1000为出发菌株,使用PCR技术克隆ilvBN与ilvC基因,对ilvBN进行定点突变,获得解除L-缬氨酸对乙酰羟酸合酶反馈抑制突变型基因ilvBN′.对基因ilvC进行点突变,获得乙酰羟酸变位酶突变基因ilvC′.通过重叠延伸PCR方法,将基因片段ilvBN′和ilvC′拼接为ilvBN′C′,进而连接至穿梭载体pXMJ19获得重组质粒pXMJ19-ilvBN′C′.该重组质粒转化至出发菌株获得工程菌株MH-1032.50L分批补料发酵结果显示:MH-1000发酵72hL-缬氨酸质量浓度为35.2g/L,MH-1032发酵72 h L-缬氨酸质量浓度为38.4 g/L,增长9.1%,糖酸转化率从21.7%提高到25.8%.     

乳糖发酵短杆菌lysC突变对L-赖氨酸积累的影响

从一株乳糖发酵短杆菌L-异亮氨酸生产菌中克隆出天冬氨酸激酶AK-1的编码基因ly-sC1,经DNA测序并与来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的野生型lysC比对发现其中有2个核苷酸1186G和1187C缺失,造成翻译提前终止。AK-1还有下列2个有效突变位点:Ala 279 Thr和Ser317 Ala。lysC1在大肠杆菌BL21中的诱导表达量约为lysC的1/4,其表观比酶活也较低,但对L-苏氨酸和L-赖氨酸协同反馈抑制不敏感。用大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭表达载体pDXW-8将ly-sC1在野生型乳糖发酵短杆菌ATCC13869中诱导型表达,经摇瓶发酵积累L-赖氨酸7.4 g/L,在3 L发酵罐上达40 g/L。     

基因敲除降低L-缬氨酸发酵中亮氨酸和异亮氨酸含量的研究

黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)是L-缬氨酸生产的重要菌株,但缬氨酸发酵中常出现亮氨酸、异亮氨酸含量超标的问题.本研究敲除编码黄色短杆菌亮氨酸和异亮氨酸合成的关键基因,自主构建得到了工程菌株MH-1000-△ilvA、MH-1000-△leuA和MH-1000-△ilvA△leuA.对这些工程菌株进行摇瓶发酵和50 L罐发酵,结果表明,工程菌株有效地降低了L-缬氨酸发酵液中L-亮氨酸和L-异亮氨酸的含量,对于缬氨酸的高纯度生产具有一定的实际意义.     

常压室温等离子体诱变与微生物液滴培养系统联用筛选L-组氨酸产生菌

利用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术,对野生型谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 14067诱变处理。通过全自动高通量微生物液滴培养系统（MMC）和平板选育组氨酸结构类似物的抗性突变株。使用48孔板发酵初筛及摇瓶发酵复筛,最终从耐受3-氨基-1,2,4-三氮唑10 g/L和D-组氨酸8 g/L的抗性突变株中筛选得到菌株Cg-F4,其L-组氨酸产量为（0.561±0.016）g/L,并且经过7次连续传代实验验证了该菌株稳定性良好。     

L-缬氨酸产生菌的原生质体融合及抗高糖融合株的筛选

通过原生质体融合技术选育出一株抗高糖的融合株。以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)NV128和黄色短杆菌(B.flavum)JV16(Leu-Ile-Met-)为亲本菌株,通过单灭活原生质体融合、高糖梯度平板筛选及进一步的硫酸二乙酯(DES)诱变,获得了一株L-缬氨酸高产菌NJ-237。同时研究了影响原生质体形成、再生的3种重要条件(青霉素、酶和渗透压稳定剂),并确定了其最佳处理浓度和时间。该融合株经7 L发酵罐培养72 h L-缬氨酸达到46.8 g/L,糖酸转化率为27.7%,比两亲株都有显著提高。     

氮源及其补加策略对L-缬氨酸发酵的影响

通过分析黄色短杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸的过程,得知在菌体生长期和快速产酸期氮源对L-缬氨酸发酵的影响不同。以黄色短杆菌XV0505为供试菌株,研究了不同氮源种类及不同氮源浓度对L-缬氨酸发酵过程的影响,选定了以豆饼水解液和硫酸铵为氮源,并确定了合适的初始氮源浓度。在初始氮源浓度相同的情况下,考察了间歇流加补氮策略、恒氮源浓度补氮策略和幂函数流加补氮策略对L-缬氨酸发酵的影响,研究发现,幂指数补氮策略可减少频繁的取样及铵浓度检测,在缺乏在线监测系统和反馈自控系统的情况下,将发酵体系中氮源浓度维持在合适值,既可适度促进菌体生长,又可使L-缬氨酸的产量得到进一步提高。在最优的氮源添加策略下,在30 L发酵罐发酵60 h,发酵液中L-缬氨酸可达63.17 g/L,糖酸转化率24.69%。     

L-缬氨酸发酵影响因素的研究

以黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）XV0505为生产菌株，研究了发酵培养基和发酵控制条件对L-缬氨酸的产量和糖酸转化率的影响。应用单因素实验确定发酵的工艺条件，利用纸层析-色班洗脱比色法测定发酵液中L-缬氨酸含量。在最优发酵条件下，通过10L罐流加发酵72h，产酸可达53．4s／L．糖酸转化率为26．7％，分别比补料分批发酵提高1l-9％和3．5％。     

加强表达3-磷酸甘油醛脱氢酶对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中,由3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)催化的反应是糖酵解途径的限速步骤,该反应还直接影响了L-丝氨酸的前体3-磷酸甘油酸的合成。研究首先比较了产L-丝氨酸的野生型菌株C.glutamicum SYPS-062与模式菌株C.glutamicum ATCC14067的GAPDH酶活力,发现SYPS-062的GAPDH酶活力比ATCC14067高了55.8%。进一步采用在C.glutamicum33a△SS基因组上增加gap A拷贝数的方法加强表达GAPDH,构建了重组菌C.glutamicum33a△SS-2gap A。重组菌GAPDH转录水平和酶活力分别提高119%和53%,最大比生长速率提高10.6%,总糖耗速率提高4.4%,L-丝氨酸产量提高17.4%,糖酸转化率提高12.2%,生产强度提高17.4%。结果表明,加强表达GAPDH能够提高重组菌的生长和糖耗速率,并能够提高L-丝氨酸的产量、糖酸转化率和生产强度。     

精氨酸合成途径关键酶基因的过量表达及其对L-精氨酸合成的影响

由CarAB、ArgD、ArgJ三个基因分别编码的氨基甲酰磷酸合成酶、乙酰鸟氨酸转氨酶、鸟氨酸乙酰基转移酶是L-精氨酸合成途径的关键酶。以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为出发菌株,利用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌的穿梭质粒pEC-XK99E-p’、PEC-T18mob2,分别对精氨酸生物合成途径的关键酶基因CarAB、ArgD、ArgJ进行单个基因表达、对ArgD、ArgJ基因进行串联表达以及对CarAB、ArgD、ArgJ三个基因进行共表达,分别得到过量表达菌株14067-pEC-CarAB、14067-T18-ArgD、14067-T18-ArgJ、14067-T18-ArgDJ、14067-pEC-CarAB-T18-ArgDJ。检测上述三个基因单独表达,串联表达及共表达对L-精氨酸产量的影响。摇瓶发酵实验证明,这五株菌产精氨酸的能力较出发菌株ATCC14067分别提高了1.61、1.14、1.19、1.28、2.91倍。产量最高的共表达菌株14067-pEC-CarAB-T18-ArgDJ,通过实时荧光定量PCR检测,表明CarA、CarB、ArgD、ArgJ基因的表达量分别是ATCC14067的2.50、5.60、3.59、4.70倍。这表明过量表达基因CarAB、ArgD、ArgJ可以有效提高精氨酸的产量。     

L-精氨酸高产菌株的亚硝基胍诱变选育和种子培养基的优化研究

为了筛选L-精氨酸的高产菌株,采用亚硝基胍对出发菌株A TCC 14067 （Brevibacterium flavum）进行诱变,结合抗精氨酸结构类似物D-精氨酸,S-甲基半胱氨酸平板抗性筛选高产菌株,并采用正交试验优化了种子培养基.结果显示,经过1 mg/mL的亚硝基胍诱变处理4min后,采用14 mg/mL的D-精氨酸抗性平板和8mg/mL的S-甲基半胱氨酸抗性平板筛选获得精氨酸高产菌株,由于解除精氨酸自身的反馈调节,L-精氨酸积累增大,产酸量达37.2 g/L,比野生菌株提高了128.2％,得到的高产菌株遗传性状稳定.通过对种子培养基进行正交试验优化,确定最终培养基配方为葡萄糖3.0％,玉米浆2.0％,硫酸铵2.0％,KH2PO4 0.10％,MgSO4·7H2O 0.05％,尿素0.15％,在此发酵条件下,L-精氨酸产量达37.8 g/L.     

L-赖氨酸高产菌选育的研究

以黄色短杆菌ATCC140 6 7为出发菌株 ,经亚硝基胍 (NTG)、硫酸二乙酯 (DES)逐级诱变处理 ,S 2 氨基乙基 L 半胱氨酸 (AEC)、磺胺胍 (SG)等氨基酸结构类似物及琥珀酸为唯一碳源平板定向育种 ,获得 1株L 赖氨酸高产菌XQ 8(AECrSucgThr- SGr)。在含有 16 0 g/L葡萄糖的培养基中 ,摇瓶发酵 72h ,L 赖氨酸积累可达 77～ 82 g/L。     

解淀粉芽孢杆菌psd基因过表达对胞苷发酵的影响

以解淀粉芽孢杆菌BG-09(Bacillus amyloliquefaciens BG-09)为出发菌株,分析代谢途径中与细胞膜渗透性有关的基因psd,研究过表达基因psd对胞苷发酵的影响。以解淀粉芽孢杆菌BG-09基因组为模板克隆psd,构建了含psd的重组质粒pHT43-psd,通过化学转化法转入菌株大肠杆菌DH5α,验证成功后将其转入B.amyloliquefaciens BG-09,获得重组菌株B.amyloliquefaciens BG-09-psd。将B.amyloliquefaciens BG-09-psd菌株通过摇瓶发酵,研究过表达基因psd对菌体的生长、胞苷和尿苷产量积累的影响。结果显示,重组菌株B.amyloliquefaciens BG-09-psd发酵液中胞苷浓度为1.199 g/L,与对照菌株B.amyloliquefaciens BG-09相比,提高了15.51%,尿苷浓度为0.552 g/L,增加了6.56%,表明过表达基因psd可促进胞苷的积累。     

生物合成对香豆酸大肠杆菌工程菌的构建

对香豆酸是一种具有预防心血管疾病、抗氧化和抗菌消炎等生物活性的酚类物质,同时,它也是高价值苯丙烷类保健营养品(如白藜芦醇)的前体。本研究希望创制出一种生物合成对香豆酸的方法,以缓解对香豆酸的供求问题。把带有粘红酵母(Rhodotorula glutinis)酪氨酸解氨酶(Rg TAL)基因的组成型表达载体转化大肠杆菌ATCC31884,并通过PCR鉴定后,获得重组菌株。对重组菌株进行发酵培养,对发酵液进行高效液相色谱检测,确定工程菌具有生物合成对香豆酸的能力。随后通过优化L-酪氨酸的添加量和工程菌的发酵时间,最终确定,底物L-酪氨酸的添加量为0.5 m M,发酵时间为36 h,检测发酵液中的对香豆酸含量最高,为161.23 mg/L。这表明,Rgtal基因在重组大肠杆菌中成功得到了表达,并且能利用自身代谢和外源添加的L-酪氨酸生物合成对香豆酸。     

降解植物甾醇产9α-羟基雄烯二酮工程菌株构建及发酵工艺优化

9α-羟基雄烯二酮(9α-OH-AD)作为一种不可替代的甾体药物中间体,是合成多种皮质类甾体激素类药物的重要原料。本研究通过在产雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)的菌株Mycobacterium sp.TFZ中表达3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)基因kshA和kshB,获得了一株可直接转化植物甾醇生产9α-OH-AD的工程菌株Mycobacterium sp.TFZ3215,然后以9α-OH-AD产量为评价指标,对油水两相转化体系中添加乳化剂吐温的种类和含量进行优化。研究结果表明:与出发菌株Mycobacterium sp.TFZ相比,工程菌Mycobacterium sp. TFZ3215发酵液中9α-OH-AD的含量由1.7%提高到94.7%,AD的含量由80.1%减少到3.4%。进一步通过在油水两相发酵体系中添加2 g/L的吐温-80后,9α-OH-AD的产量由1.69 g/L增加到7.53 g/L,提高了3.4倍。本研究成功构建了高产9α-OH-AD的工程菌株,并对油水两相发酵体系进行了优化,9α-OH-AD的产量达到7.53 g/L,具有极好的产业化前景。     

L-缬氨酸高产菌诱变育种的研究

以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)L-缬氨酸产生菌XQ-2为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)逐级诱变处理,氨基酸结构类似物α-氨基丁酸(-αAB)、2-噻唑丙氨酸(2-TA)和α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)定向筛选,获得一株L-缬氨酸高产菌XQ-8(Leul(-ABhr2-TAhrAHVhr)。在以135 g/L葡萄糖为碳源和50 g/L硫酸铵为氮源的培养基中摇瓶发酵72 h,产酸达64~66 g/L。     

产L-亮氨酸营养缺陷型突变株黄色短杆菌SFL8-3的选育

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是生物体内不可缺少的营养成分，L-亮氨酸是人体8种必需氨基酸之一，也是三种支链氨基酸之一，在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有重要的用途。以一株黄色短杆菌为出发菌株，经紫外线、盐酸羟胺和硫酸二乙酯等多次诱变处理，单菌落分离、摇瓶初筛和摇瓶复筛，获得了一株蛋氨酸和异亮氨酸双重缺陷型突变株SFL8-3（Met^-，Ile^-），摇瓶发酵L-亮氨酸产量达18．98g／L。