市售婴幼儿食品中克罗诺杆菌分离菌株脉冲场凝胶电泳分型及耐药性研究

目的研究婴幼儿食品中克罗诺杆菌分离菌株的分子分型特征和耐药情况。方法 2010—2016年在国内32个企业生产的婴幼儿食品中分离获得50株克罗诺杆菌,使用限制性内切酶XbaⅠ对基因组DNA进行酶切和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,利用BioNumerics软件进行聚类分析,采用微量肉汤稀释法进行药敏试验,分析分离菌株的耐药情况。结果 50株克罗诺杆菌分为47个PFGE型,相似度为28.7%～100.0%,具有较高的遗传多态性。不同地区、不同企业的分离株分散在各簇,无地区聚集性和特异性,但有2个企业不同批次产品的分离菌株分别属于同一克隆株。50株克罗诺杆菌对萘啶酸、环丙沙星、头孢吡肟、阿米卡星、头孢噻肟和头孢曲松均敏感,对磺胺嘧啶、氨苄青霉素、氯霉素、复方新诺明、阿莫西林-克拉维酸、卡那霉素和庆大霉素具有不同程度的耐药,7株克罗诺杆菌表现出对抗生素的多重耐药性。结论部分婴幼儿食品加工企业存在克罗诺杆菌持续污染,且有多重耐药株出现,应加强关注。     

婴儿配方粉干法加工过程肠杆菌科和克罗诺杆菌属监测

目的了解婴儿配方粉干法加工过程中肠杆菌科和克罗诺杆菌属的分布,掌握终产品中克罗诺杆菌属的污染途径。方法对4家企业的产品相关样品(原辅料、中间产品和终产品)和环境进行监测,选择传统分离培养方法对肠杆菌科和克罗诺杆菌属进行检验,利用脉冲场凝胶电泳技术进行克罗诺杆菌属溯源研究。结果地面、空调回风口和使用后的清洁工具中肠杆菌科检出率较高,均在20%左右。产品相关样品、清洁作业区环境相关样品中克罗诺杆菌属检出率分别为2.56%(12/468)和0.27%(6/2 185),22株分离株共有13种脉冲场凝胶电泳(PFGE)带型,每个企业的指纹图谱各不相同,其中有四组分离株分别具有同源性。终产品中克罗诺杆菌属的污染主要来自原辅料,其次为环境中定植的菌株。结论该研究对掌握婴儿配方粉加工企业肠杆菌科和克罗诺杆菌属的污染分布及终产品中克罗诺杆菌属的可能污染源,制定加工过程的卫生控制措施,确保终产品的安全具有重要意义。     

婴幼儿配方粉生产中克罗诺杆菌溯源研究

结合陕西省两个婴幼儿配方乳粉加工厂婴配粉生产工艺,对生产原辅料、车间环境、加工设备及工厂周边土壤进行采样,检测克罗诺杆菌的污染状况,并对菌株进行脉冲场凝胶电泳(Pulse field gel electrophoresis,PFGE)分型溯源,定位克罗诺杆菌在生产过程的污染点.结果 表明,采集的1246份样品中检出14...     

我国4省肉鸡屠宰场沙门氏菌脉冲场凝胶电泳分子分型

目的 了解我国四省肉鸡屠宰场沙门氏菌脉冲场凝胶电泳分子分型情况.方法 参照美国疾病预防控制中心PulseNet实验方法,对2010年监测4省肉鸡屠宰场分离到的167株沙门氏菌,运用Xba Ⅰ酶进行酶切并完成PFGE分析,利用BioNumerics软件对分离株的指纹图谱进行聚类分析并建立数据库.结果 167株沙门氏菌共分为18个群,包括了75个不同的带型.相同血清型具有相似带型,基本归于同一群.65株印地安纳沙门氏菌有38个带型,54株肠炎沙门氏菌有16个带型,16株奥尔巴尼沙门氏菌仅有1个带型.结论 各省沙门氏菌的带型具有地区性差异,又具有优势型别的交叉.屠宰场存在严重的交叉污染,加强加工环节中的关键控制点—沙门氏菌的监测和干预,从而降低肉鸡及其产品中沙门氏菌的污染,这是从源头控制污染的根本措施.     

婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的分离鉴定及分型

采集了市场中的220份婴儿配方乳粉,利用生理生化和分子鉴定的方法对采集样品中的克罗诺杆菌进行了分离鉴定,检出10株克罗诺杆菌,污染率为4.55%。利用16S r RNA和omp A基因对克罗诺杆菌进行分型分析,都将10株克罗诺杆菌分为了2个簇,但是不同分型方法各个簇中的菌株不同。结果表明16S r RNA和omp A基因可以用于克罗诺杆菌的分型,但是辨识度不高。     

婴幼儿食品源阪崎克罗诺杆菌的3种分型方法

阪崎克罗诺杆菌污染婴幼儿食品可能导致新生儿和婴幼儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎,对其健康造成严重威胁。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)和肠杆菌间保守重复序列PCR(ERIC-PCR)对分离于婴幼儿配方乳粉、米粉和辅食中的阪崎克罗诺杆菌进行分子分型,计算3种分型方法的辛普森多样性指数(DI)值,评价3种方法的分型效率,以便精确和快速开展阪崎克罗诺杆菌流行病学研究。PFGE、MLST和ERIC-PCR可分别将37株阪崎克罗诺杆菌分为35个PFGE基因型、28个ERIC-PCR型和23个序列(ST)型,分型结果的DI值分别为99.55%,96.40%和98.05%。3种方法对阪崎克罗诺杆菌均具有较高的分型能力,其中PFEG分型能力最高,分型效率最佳。     

山东地区大肠杆菌的耐药性及分子分型研究

目的了解山东地区肉鸡养殖环节大肠杆菌的分布情况,初步揭示山东地区大肠杆菌分离株的耐药性及分子流行规律和特征,为该菌的分子溯源及风险评估提供依据。方法选取山东地区2000—2012年肉鸡养殖场分离的42株大肠杆菌为研究对象,用13种抗菌药物进行药物敏感性试验,选用脉冲场凝胶电泳(PFGE)及多位点序列分型(MLST)两种分型方法对菌株进行分析。结果 PFGE方法可分为34个带型,菌株之间的相似系数为60%~100%,带型比较分散,未发现绝对优势的带型;MLST方法得到18个序列型(ST),菌株的7个管家基因均有不同程度的变异;耐药性结果显示,42株菌均为多重耐药,对氨苄西林(AM)、复方新诺明(SXT)和氧氟沙星(NOR)的耐药率较高,分别为97.62%、92.86%和90.48%。结论山东省部分地区肉鸡养殖场中大肠杆菌耐药谱较广,耐药现象比较严重,菌株基因呈多态性,菌株分布具有一定的时间性和地区性。     

限制性内切酶组合对阪崎克罗诺杆菌的脉冲场凝胶电泳基因分型效果的影响

目的利用多种限制性内切酶提高脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)技术对阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter Sakazakii)的分型效果,找到更多的以PFGE为基础的阪崎克罗诺杆菌分子分型信息。方法本研究选用XbaⅠ、SpeⅠ、NheⅠ和BlnⅠ分别酶切34株克罗诺杆菌分离株的DNA,并经PFGE得到相应的基因图谱,通过束平均数、束菌株百分比、结与菌株比值与Simpson多样性指数对各限制内切酶以及结合酶的相对分辨率进行评价。结果 NheⅠ是PFGE单酶切分型中效果最好的一种限制性内切酶;4种限制性内切酶相结合的分型方法可提高PFGE阪崎克罗诺杆菌基因分型效果。结论运用PFGE技术对菌株进行亚分型时,选用的酶种类越多,则结果越可靠,使用XbaⅠ、SpeⅠ、NheⅠ、BlnⅠ4种内切酶结合分析,可以得到理想的菌株亚分型结果。     

婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染调查及分子分型研究

目的了解温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染情况及分子分型特征,分析不同菌株间亲缘相关性。方法参照GB 4789.40—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》方法在食品中分离鉴定克罗诺杆菌。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法对克罗诺杆菌进行分型研究。结果 2013—2017年共采集737份婴幼儿食品和配方奶粉,克罗诺杆菌总检出率为6.1%(45/737)。其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高(23.4%,37/158)。45株克罗诺杆菌属于阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)和莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)。其中阪崎克罗诺杆菌最多(73.3%,33/45),其次为丙二酸盐克罗诺杆菌(24.4%,11/45)。MLST共分为25个ST型,其中ST64、ST1、ST40、ST4和ST7为优势型别。45株克罗诺杆菌PFGE分型得到38个带型,未发现有明显的优势分型和聚集现象。PFGE型和MLST型结果分析表明,绝大数具有相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型,而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系。结论温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌的污染状况较轻,其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高。食品来源的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性。     

利用全基因组序列优化气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法

目的对气单胞菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法从限制性内切酶的选择和电泳条件设置上进行优化,减少片段共迁移,使片段在电泳中分布均匀且利于分析。方法利用6个种的气单胞菌的全基因组数据,通过BioEdit软件对基因组序列进行677种酶的限制性片段分析,选择产生片段数量适宜的、有效片段比例高的酶作为备选酶。对片段长度取以10为底的对数作为自变量,以片段在泳道中的相对迁移距离作为应变量,计算片段长度-相对位置拟合公式,并模拟备选酶的电泳效果图。利用气单胞菌分离株对备选酶进行试验验证,确定PFGE分型方法,并用其对腹泻分离株进行分型应用。结果经Bio Edit分析,根据片段数量及有效片段比例,PmeⅠ、PacⅠ、SwaⅠ比XbaⅠ更适合于气单胞菌的分型。从PFGE模拟效果及分离株试验验证看,Pac Ⅰ、PmeⅠ的限制性片段的分布比XbaⅠ和SwaⅠ更均匀,片段重叠更少。最终确定PmeⅠ、PacⅠ分别为气单胞菌PFGE分型的首选酶和次选酶,脉冲场电流转换时间为2.16~63.8 s。16株腹泻分离株PFGE分型辛普森多样性指数为99.17%。结论优化的PFGE方法使用PmeⅠ、PacⅠ作为气单胞菌PFGE分型的限制性内切酶,该方法产生的片段数量与分布都优于XbaⅠ,在腹泻分离株的分型中能获得良好的分辨率。此研究提供的优化程序可用于其他细菌PFGE方法的建立或优化。     

Microbiological Quality of Raw Dried Pasta from the German Market,with Special Emphasis on Cronobacter Species

The microbiological quality of 132 dried pasta products available on the German market, originating from 11 different countries, was studied. Sample materials included soft or durum wheat products, some of which produced with other ingredients such as eggs, spices, or vegetables. Parameters included hygiene indicators (aerobic plate count, mold count, the presence of Enterobacteriaceae) and pathogenic/toxinogenic bacterial species (Salmonella spp., Staphylococcus aureus, presumptive Bacillus cereus, and Cronobacter spp.). The overall results of hygiene parameters indicated a satisfactory quality. Salmonella was not found in any sample. Three samples were positive for S. aureus (10² to 10⁴ colony forming unit (CFU)/g). Presumptive B. cereus at levels of 10³ to 10⁴ CFU/g were detected in 3 samples. Cronobacter spp. were isolated from 14 (10.6%) products. Of these, 9 isolates were identified as C. sakazakii, 2 each as C. turicensis and C. malonaticus, and 1 as C. muytjensii. The isolates were assigned to 9 multilocus sequence typing (MLST) sequence types and to 14 different PFGE profiles. Although pasta products are typically cooked before consumption, some consumers, and children in particular, may also eat raw pasta as nibbles. Raw pasta seems to be a relevant source of exposure to dietary Cronobacter spp., although health risks are probably restricted to vulnerable consumers. High numbers of presumptive B. cereus as found in some samples may be a risk after improper storage of cooked pasta products because toxinogenic strains are frequently found within this species.     

分子生物学技术在一起食物中毒检测中的应用

应用分子生物学技术对一起食物中毒样品进行检测,提高实验室应对食物中毒快速检测和溯源分析能力。方法 应用实时荧光PCR技术对一起食物中毒10份患者粪便和6份可疑食品进行快速检测,并对39份粪便和8份食品进行病原培养分离鉴定,应用PCR技术对分离菌株进行invA毒力基因检测,PFGE及MLST基因分型技术对分离菌株进行同源性分析,并与其他地区菌株进行遗传学差异对比。结果 10份患者粪便和6份可疑食物经实时荧光PCR检测均为沙门菌阳性,从39份粪便和8份食品中共分离到31株肠炎沙门菌。PFGE及MLST分析显示31株菌具同源性,表明食物和患者分离菌株基因型别一致,MLST分型显示本次分离株与其他地区优势克隆有同源性,31株肠炎沙门菌均具有invA毒力基因。结论 实时荧光PCR技术应用于食物中毒病原检测,缩短了病原检测周期,提高了检测的准确性,PFGE及MLST两种基因分型技术可对病原菌进行溯源分析,对于掌握病原菌流行规律具有重要意义。     

两起肠炎沙门菌所致食物中毒的病原学研究及溯源分析

目的探讨两起同地区连续发生的肠炎沙门菌食物中毒分离株之间的分子流行病学关系。方法参照GB 4789.4—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》方法进行病原分离培养,对检出菌株进行表型鉴定;用VITEK-ⅡCompact全自动微生物分析系统检测菌株抗生素敏感性;采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对检出菌株进行分子分型和流行病学特征分析。结果共检出23株肠炎沙门菌,其中从25份患者肛拭样本中检出17株,8份从业人员肛拭样本中检出2株,8份留样食物中检出3株,厨具涂抹样本中检出1株。23株肠炎沙门菌血清抗原式均相同(9∶g,m∶-);生物学性状和药敏试验结果基本一致;PFGE图谱带型完全一致(相似度为100%),且与当地散发病例PFGE图谱带型相似。结论综合流行病学调查、病原学检测和分子分型结果,证实这两起食物中毒是由同一来源的肠炎沙门菌污染所引起。     

四川省鸭和猪源鼠伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳分型与耐药比较分析

目的比较研究四川省鸭和猪源鼠伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型与耐药特征,为分析鼠伤寒沙门菌食品来源提供支持。方法将鸭和猪源监测中分离的47株鼠伤寒沙门菌进行PFGE分型,并采用最小抑菌浓度法测定9种药物敏感性。结果鸭和猪源中分离的鼠伤寒沙门菌在PFGE分型和耐药上存在差异。鸭源菌株聚集于簇I,而猪源菌株聚集于簇II。簇II菌株对氨苄西林、环丙沙星、氯霉素、庆大霉素、四环素、复方新诺明6种药物的耐药率高于簇I菌株。不同的PFGE分型鼠伤寒沙门菌在监测地区和耐药谱存在差异。SCSTm-10型菌株均分离于绵阳地区,SCSTm-11型主要分离于资阳地区。SCSTm-10型菌株对复方新诺明和环丙沙星的耐药率高于SCSTm-11型菌株。结论 PFGE分型可以获取四川省鼠伤寒沙门菌分离来源、分离地点和耐药的聚类信息,为鼠伤寒沙门菌食物中毒提供流行病学调查支持。     

一起副溶血性弧菌食物中毒分离株的特征分析

目的 分析2017年广州市一起副溶血性弧菌食物中毒分离株的特征.方法 采用血清型鉴定,药敏实验,毒力基因(tdh、trh、tlh)、toxRS/new基因、orf8基因的聚合酶链式反应(PCR)检测,脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)进行分析.结果 14株副溶血性弧菌血清型鉴定为O8∶K21,药敏试...     

婴幼儿配方乳粉加工环境中蜡样芽孢杆菌多位点序列分型

以分离自婴幼儿配方乳粉加工环境中蜡样芽孢杆菌为研究对象,利用多位点序列分型(MLST)技术对蜡样芽孢杆菌的多样性和系统进化关系进行探究。结果表明,84株蜡样芽孢杆菌共分成24个ST型,分别是ST-24、ST-26、ST-32、ST-62、ST-144、ST-374、ST-999、ST-1119、ST-1243、ST-1284、ST-1333、ST-1334、ST-1335、ST-1336、ST-1337、ST-1338、ST-1339、ST-1340、ST-1341、ST-1342、ST-1343、ST-1344、ST-1345及ST-1347,其中ST-999(22.62%)、ST-1343(15.48%)、ST-1335(7.14%)与ST-1345(7.14%)是该婴幼儿配方乳粉加工环境中的优势ST型。同时发现了3个新的等位基因pur-242,pyc-198,ilv-276与14个新的ST型ST-1333、ST-1334、ST-1335、ST-1336、ST-1337、ST-1338、ST-1339、ST-1340、ST-1341、ST-1342、ST-1343、ST-1344、ST-1345和ST-1347。系统发育分析表明24个ST型与B.cereus、B.anthracis和B.thuringiensis这三个种显示了更近的系统发育关系,与蜡样芽孢杆菌群体中的另外8个种的亲缘关系较远。     

一起食物中毒病原菌斯坦利沙门菌的分子分型及耐药性分析

目的对引起跨区域食物中毒的斯坦利沙门菌分离株进行耐药性检测和分子分型分析,追溯并明确病因食品,为该菌防控工作提供科学依据。方法采用微量肉汤稀释法对15株斯坦利沙门菌进行18种抗生素敏感性试验,同时对菌株基因组DNA经限制性内切酶Xba I酶切后进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型,并与数据库中其他沙门菌比较。结果此次疫情分离菌株中食品分离株和腹泻患者分离株血清型一致,耐药谱基本一致。经PFGE溯源分析后具有100%同源的PFGE带型,数据库中无相同带型的菌株。结论本起跨区域食物中毒是由斯坦利沙门菌污染的煮花生引起,分离菌株对红霉素耐药,对氯霉素处于中介,对其他抗生素敏感。