广东客家娘酒发酵过程中产β-葡萄糖苷酶酵母菌的筛选及酶学性质研究

采用七叶苷分离培养基初筛、4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPGal）显色法复筛的方法从广东客家娘酒发酵过程中的酒糟中筛选产β-葡萄糖苷酶能力较强的酵母菌,通过26S rDNA D1/D2区基因序列分析对其进行鉴定,并对其酶学性质进行分析。结果表明,获得1株产β-葡萄糖苷酶能力较强的假丝酵母Candida apicola kj_312。该菌株所产的β-葡萄糖苷酶具有较宽的底物特异性,最适底物为对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷;最适反应温度为60 ℃,在25～65 ℃范围内,相对酶活力＞50%;最适pH值为4.5,在pH值为4.0～7.0酸性范围内,相对酶活力＞80%;1 mmol/L的Ca2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+及100 mmol/L的Ca2+、Zn2+和Fe2+能显著提高酶活力。     

产β-葡萄糖苷酶非酿酒酵母的筛选及酶学特性研究

通过对新疆石河子葡萄产区葡萄中的酵母菌的筛选,采用酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基分离纯化菌株,并对分离菌株进行分子生物学鉴定。利用对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷为底物筛选产β-葡萄糖苷酶酶酵母菌,得到一株高产糖苷酶毕赤酵母属(Pichia sp.)的非酿酒酵母菌株Y8,并研究该菌株的产β-葡萄糖苷酶酶学特性。结果表明,β-葡萄糖苷酶的最适初始p H值为5.0,最适产酶温度为30℃,反应时间为15 min,最适葡萄糖质量浓度为15 g/100 m L。     

黑曲霉产β-葡萄糖苷酶发酵培养基的优化研究

利用响应面方法对黑曲霉产β-葡萄糖苷酶的发酵培养基进行了优化,研究碳源、氮源、无机盐和pH对β-葡萄糖苷酶活力的影响.利用Box-Benhnken设计和响应面方法对碳源浓度、氮源浓度、初始pH进行试验分析.结果表明,β-葡萄糖苷酶的最佳发酵培养基为:麸皮2%,蛋白胨0.1%,KH2PO40.1%,初始pH6.0.经发酵后的β-葡萄糖苷酶活力达325.62 u/mL.     

短小芽孢杆菌碱性β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

以毕赤酵母密码子为基准,对短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因密码子进行优化,设计合成全基因序列,构建表达载体转入毕赤酵母中。结果表明,短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因已成功转入酵母菌中并分泌表达,诱导培养72h发酵液的酶活力可达25.39U/mL。重组酶最适反应温度45℃,最适pH 9.0,重组酶的K_m值1.26mmol/L,V_(max)为32.15μmol/(min·mg)。重组β-葡萄糖苷酶对大豆苷水解活性相对活力是pNPG的248%,转糖苷活性催化50%底物葡萄糖合成龙胆二糖,达34.25g/L。     

产β-糖苷酶菌株的筛选及酶活的研究

利用对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷为底物筛选酿酒酵母菌,得到1株高产糖苷酶的酿酒酵母菌。以该菌株作为实验菌株,研究该菌株的酶活特性,对酿酒酵母菌酶活性测定条件进行研究。通过单因子试验,确立了该菌株发酵对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷酶的最适培养条件：pH4．0,温度为40℃,发酵时间为6h。高浓度的葡萄糖、果糖对酶活没有抑制作用,酒精度超过14％vol时对产酶有抑制作用。     

普鲁兰酶逆向合成麦芽糖基β-CD的工艺研究

以麦芽糖和β-CD为底物,用酸解普鲁兰菌产普鲁兰酶(EC3-21.41)逆向合成麦芽糖基β-CD。为了优化反应条件,对温度、pH、底物浓度等分别进行了单因素实验和L9(34)正交实验。实验结果表明,酶量显著地影响β-CD的转化率,最佳反应条件为温度70℃,pH为4.0,底物量比为18,底物浓度为75%,酶量为200U/gβ-CD,反应时间为60h,β-CD的转化率超过了40%。     

β-葡萄糖苷酶高产菌株的选育及酶法转化葡萄糖生产龙胆低聚糖

以高产β-葡萄糖苷酶米曲霉为出发菌株,经紫外-60Co复合诱变处理,用不同葡萄糖浓度梯度的β-葡萄糖苷酶鉴定平板筛选,在含4%葡萄糖的鉴定平板上获得1株抗葡萄糖阻遏的突变株ASPE0485,β-葡萄糖苷酶水解酶活提高1.78倍,达到17.65U/mL。ASPE0485所产β-葡萄糖苷酶与高浓度葡萄糖反应,薄板层析和高效液相色谱检测反应产物有龙胆低聚糖,表明ASPE0485所产β-葡萄糖苷酶具有转苷活性;对酶转化葡萄糖生产龙胆低聚糖的反应条件进行了优化:当底物葡萄糖浓度为60%,pH3.0,反应温度为50℃,转化周期为72h,龙胆低聚糖累计达到最大,为44.16g/L。     

蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性测定及来源分析

以对硝基苯基β-D- 葡萄糖苷(pNPG)为底物,对蜂蜜中β- 葡萄糖苷酶活性测定条件进行研究。结果表明：蜂蜜中β- 葡萄糖苷酶活性测定的最佳条件为以柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液为提取液,pH5.0,温度60℃,底物浓度30mmol/L。酶促反应在2.5h 和37℃时酶促反应曲线线性关系最好。研究还发现,β- 葡萄糖苷酶可能是蜜蜂在采集加工过程中加入进去的,同时,该酶活性还可能与蜂蜜的新鲜度相关。     

绞股蓝内生真菌多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

目的:探究绞股蓝内生真菌JY25多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,为绞股蓝内生真菌多糖的应用提供基础数据。方法:确定4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glu-copyranoside,PNPG)比色法检测α-葡萄糖苷酶活力的最佳条件,以阿卡波糖为阳性对照,采用优化后的最佳条件测定JY25多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并确定抑制类型、计算抑制常数;以Caco-2细胞作为体外产α-葡萄糖苷酶模型,测定JY25多糖的抑制效果。结果:反应时间30 min、反应温度44℃、pH 6.8、底物(PNPG)浓度5 mmol/L为PNPG比色法的最佳反应条件。以此优化条件进行比色,当JY25多糖质量浓度为6.15 mg/mL时,对α-葡萄糖苷酶抑制率达到最大(68.21%);JY25多糖的半数抑制浓度(IC_(50))为(2.46±0.42)mg/mL,抑制常数Ki为1.15 mg/mL,JY25多糖为竞争性抑制剂。在JY25多糖质量浓度为10.00 mg/mL时,对培养16 d的Caco-2细胞所产α-葡萄糖苷酶的抑制率达到16.48%。结论:体外实验证实JY25多糖具有竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的作用。     

自选酿酒酵母（KDLYS9-3）产β-D-葡萄糖苷酶动力学研究

自选高产β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母(KDLYS9-3)在葡萄酒酿造过程中具有增强香气的效果。依据菌体生长和产酶试验,利用Logistic方程、Dose Resp方程和Nelder方程建立了菌体生长和产酶,以及菌体生长速率与酶生成速率之间关系的动力学模型,通过Origin8.0软件进行非线性拟合,并利用Lineweaver-Burk法作图测定了该菌所产β-D-葡萄糖苷酶的动力学参数K_m值和V_(max)值。结果显示:自选酿酒酵母KDLYS9-3的菌体生长与产酶的相关性为部分偶联型,动力学模型与试验值吻合度好,方程能够反映菌体生长与产酶的变化规律。菌体生长8 h后开始产酶,菌体进入对数生长期时酶大量生成,到39 h菌体生长进入稳定期,随着菌体生长进入衰亡期后酶也随之停止产生;利用Lineweaver-Burk法求得酶动力学参数K_m=8.492 579 mmol/L,V_(max)=1.030 715(μmol/L)/min。研究结果为该菌株的理论研究和实际应用奠定了基础。     

植物乳杆菌β-D-葡萄糖苷酶的定位及活性研究

以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷为底物,通过比色法从5株植物乳杆菌中筛选出2株有较高β-D-葡萄糖苷酶酶活力的菌株,并利用差速离心分级沉淀对其β-D-葡萄糖苷酶进行定位。根据对植物乳杆菌的生长状况的分析,测定其在不同生长条件下β-D-葡萄糖苷酶的酶活力。结果表明:目的菌株体内的β-D-葡萄糖苷酶为胞内酶,属于细胞膜结合酶;该酶在对数生长末期(培养至12 h)酶活力最高,最适产酶培养基为改良MRS培养基;以完整细胞为参照对象,植物乳杆菌520、XJ-25菌株所产的β-D-葡萄糖苷酶均受纤维二糖及熊果苷的诱导,熊果苷的诱导作用较强。     

产β-葡萄糖苷酶酿酒酵母菌株的化学诱变选育及产酶条件优化

以实验室保存的一株酿酒酵母菌株UV-45为出发菌株,通过硫酸二乙酯(DES)诱变筛选及致死率测定,得到一株产β-葡萄糖苷酶稳定,酶活为74.26 U/m L的突变菌株UV-E-16,与出发菌株相比,其酶活提高了22.74%;通过Plackett-Burman方法对该菌株发酵产酶的相关因素进行分析,得出初始p H、培养温度和接种量为显著影响因子;利用Box-Behnken实验设计和响应曲面法获得其最佳产酶条件为初始p H5.62、培养温度29.5℃、接种量6.12%,该条件下,菌株UV-E-16产β-葡萄糖苷酶酶活为90.91 U/m L。经化学诱变及响应面优化产酶条件,出发菌株UV-45产β-葡萄糖苷酶酶活力提高了50.24%,具有工业化应用的潜力。     

响应面法优化米曲霉3.48 1产β-葡萄糖苷酶发酵工艺的研究

对菌株米曲霉(Aspergillus Oryzae)3.481产β-葡萄糖苷酶发酵工艺进行研究.通过单因素试验确定最佳碳源、氮源、pH和无机盐.采用响应面Box-Benhnken中心组合试验设计,优化米曲霉发酵生产β-葡萄糖苷酶的工艺条件,同时建立酶活力随麸皮+淀粉(1:1,W/W)质量分数、硫酸铵质量分数和初始pH变化的二次回归方程.结果表明:最优发酵条件是麸皮+淀粉(1:1,W/W)质量分数10.93%、硫酸铵质量分数0.4%、pH5.0,在此条件下β-葡萄糖苷酶活力可达1.89 U/mL.     

磷脂酶酶活力测定条件的优化

采用无油磷脂为底物,酸碱滴定法测定磷脂酶LecitaseUltra的酶活力,在单因素试验的基础上,选定反应时间、反应温度、反应pH值进行响应面分析试验,建立磷脂酶酶活力的二次回归方程,通过响应面分析得到酶活力测定的优化组合条件。结果表明:反应时间、反应温度、反应pH值对酶活力都有极其显著影响,测定酶活力的最佳条件为:底物质量浓度4g/100mL、终点pH 9.0、酶液稀释倍数100倍、反应pH5.1、反应温度53℃、反应时间8min,得到磷脂酶的酶活力为9550U/g。     

从长白山阔叶林中筛选β-葡萄糖苷酶产生菌及其酶学性质研究

利用马丁氏培养基富集、PDA培养基纯化和七叶灵培养基显色,从长白山阔叶林中初步筛选出6株产β-葡萄糖苷酶的真菌。对真菌发酵生成的β-葡萄糖苷酶进行提取和纯化,测得10号菌株的β-葡萄糖苷酶活力最高为18.34 U/mL,形态学和分子学结合方法鉴定该菌株为草酸青霉(Penicillium oxalicum)。该菌株所产β-葡萄糖苷酶最适反应温度约为55℃,在温度30、40℃和50℃时较为稳定。最适反应pH值约为5,在pH值为5~6之间相对较稳定。Cu~(2+)对酶活力有较强的抑制作用,而Ag~+有较强的激活作用。     

一种测定酱油曲中蛋白酶活力方法研究

以底物Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA(琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-亮氨酰-对硝基苯胺)在蛋白酶催化下生成显色基团对硝基苯胺为基础,结合多功能酶标仪检测显色基团对硝基苯胺(pNA)含量,建立酱油曲中蛋白酶活力的新检测方法。在单因素试验的基础上,选定底物浓度、反应pH值、反应温度3个因素的3个水平进行中心组合试验,通过响应面分析得出酶活测定最优条件。结果表明,底物浓度、反应温度对酶活有显著影响,酶活测定的最佳条件为:底物浓度2.23mmol/mL,反应温度40.6℃,反应pH值为8.7。同时与GB/T23527-2009《蛋白酶活力的测定福林法》的方法进行了比对,新建立方法与国家标准方法检测结果具有显著相关性(R2=0.903)。     

不同β-葡萄糖苷酶性能分析及对罗汉果苷的转化

以Pichia pastorisGS115为宿主,对来源于特异腐质霉Humicolainsolens、棘孢曲霉Aspergillus aculeatus和黑曲霉Aspergillus niger的β-葡萄糖苷酶基因bglHi、bglAa和bglAn进行异源表达。以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,分析了3种酶的酶学性质,其中BglAn的酶活力最高,为90.83U/mg。3种酶的最适反应温度和最适pH值范围分别为55~65℃和5.0~6.0。在pH值为6.0、温度50℃、酶量2U的条件下,利用3种酶水解不同浓度的罗汉果苷Ⅴ。结果表明:不同来源的酶水解底物的特异性差别较大,其中BglHi和BglAa水解罗汉果苷Ⅴ生成罗汉果苷ⅢE的转化率较低,仅为5%~7%;而BglAn在底物质量浓度1mg/mL,反应20min时转化率为96.5%;提高底物质量浓度到5mg/mL,反应1h时转化率也可达97.9%,基本实现完全转化。通过酶法转化罗汉果苷Ⅴ,获得了较高纯度的产物罗汉果苷ⅢE,为后期开发不同结构、不同功能罗汉果苷类甜剂提供了新的途径。     

高产β-葡萄糖苷酶野生酵母的筛选及产酶能力差异性分析

为了比较分析野生酵母菌产β-葡萄糖苷酶的情况,筛选高产β-葡萄糖苷酶的酵母菌株,该研究采用七叶灵显色法和4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）显色法对从宁夏贺兰山东麓分离的941株野生酵母的产β-葡萄糖苷酶能力进行筛选,通过WL培养基上的酵母菌落形态和26S rDNA D1/D2区的序列分析对所有酵母菌株进行分类鉴定,并且对酵母产β-葡萄糖苷酶能力进行差异性分析。 结果表明,941株酵母被鉴定为14个种,且筛选出了4株酵母菌高产β-葡萄糖苷酶：菌株SLY-4（98.51 U/L）、F2-24（76.93 U/L）、 F2-16（62.72 U/L）和HX-13（47.95 U/L）。 产酶能力差异性分析表明β-葡萄糖苷酶广泛分布于14种酵母,但是产酶能力表现出明显的种间和种内差异性。     

响应面法优化黑曲霉HQ-1产β-葡萄糖苷酶的固体发酵条件

采用单因素试验和响应面法对黑曲霉(Aspergillus niger)HQ-1产β-葡萄糖苷酶的固体发酵条件进行了优化,得到产酶的最佳发酵条件为:玉米秸秆粉6.0 g、麦麸6.0 g、(NH4)2SO41.5 g、KH2PO41.6 g、MgSO4.7H2O 0.8 g、含水量73.4%、起始pH3.91、培养温度和培养时间分别为33.7℃和96 h。优化后,β-葡萄糖苷酶比活力最高为8.244μkat/g,比未优化的酶比活力最高值(1.700μkat/g)提高了3.85倍。     

两株素食者肠道菌产β-葡萄糖苷酶考察及产酶条件优化

采用对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷法,与黑曲霉相比较考察素食者肠道菌LJ-G1、LJ-Q2产β-葡萄糖苷酶能力,再经单因素、响应面试验对菌种的产酶条件进行优化。结果表明:LJ-G1、LJ-Q2菌株均能产β-葡萄糖苷酶,且LJ-Q2产酶能力高于LJ-G1,与黑曲霉相比较,在发酵时间短于64 h时LJ-G1、LJ-Q2产酶能力高于黑曲霉;LJ-Q2菌种的最优产酶条件为:培养基p H 8.0、培养温度38℃、培养时间38 h。在最优条件下进行验证实验,酶活力达到1.70 IU/m L。加入大豆异黄酮原料进行发酵培养,得到游离大豆异黄酮转化率为39.4%。