重组人γ-干扰素包涵体稀释复性

采用稀释法研究了重组人γ-干扰素包涵体复性条件,如温度、pH值、蛋白浓度、复性液中脲浓度,同时对加样操作方式进行了考察,得到了较为适宜的复性条件.结果表明,脲能有效地抑制复性过程中蛋白质的聚集,合适的脲浓度随复性蛋白浓度的增加而有所增大,在4℃、pH值8.0、脲浓度1.0mol•L^-1、蛋白浓度0.1mg•ml^-1及脉冲加样操作方式等条件下,复性后重组人γ-干扰素的活性为2.39×10⁵ IU•ml^-1,比活达2.21×10⁷ IU•mg^-1.     

疏水层析法复性重组人γ-干扰素

重组人γ-干扰素（rhIFN-γ）在大肠杆菌中高效表达,并形成包涵体.利用疏水作用层析（HIC）法对rhIFN-γ 进行复性.采用了等尿素梯度和线性尿素梯度两种复性方法,考察了线性尿素梯度下尿素梯度长度、尿素终浓度、流速和上样量对rhIFN-γ复性的影响.在优化的线性尿素梯度复性条件下,尿素浓度在10个柱体积内从6 mol•L^-1下降到2 mol•L^-1,流速为1 ml•min^-1、上样量为0.568 mg时,rhIFN-γ的活性收率比稀释复性法提高6.5倍,蛋白质量收率为36%,比活达1.9×10⁸ IU•mg^-1.     

重组人γ-型干扰素单克隆抗体的鉴定

5株小鼠杂交瘤细胞ID5、1C10、1C11、3H9和6F8，所分泌抗重组人γ－型干扰素（rIFN－γ）单克隆抗体经双扩散试验证明其中4种为小鼠IgG1型，另一种为IgG2b型。用ELISA间接法测定小鼠腹水抗体效价为1：8000～1：128000。经免疫印迹试验证实5种单抗均能特异地识别rIFN－γ，其中1D5、3H9和1C11单抗对rIFN－γ具有中和活性，中和效价＞1：8000，用2种单抗建立的ELISA夹心法检测rIFN－γ，最低可测值为10．0ng／ml，且与白细胞介素－2，重组人α和β干扰素无交叉反应。     

重组人成骨蛋白-1复性条件的优化

目的优化重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)包涵体蛋白的复性条件。方法将表达rhOP-1的大肠杆菌菌体在冰浴下超声裂解,分离提取包涵体,用8mol/L尿素溶解,纯化后进行梯度透析复性。利用TotalLab软件分析目的蛋白二聚体的含量,用体内法和体外法测定其生物学活性。结果经纯化后,目的蛋白纯度达97%以上。最佳复性条件为4℃,pH9.0,蛋白浓度为0.4～0.8mg/ml,尿素浓度为2mol/L,L-Arg浓度为0.4mol/L;目的蛋白复性率达75%以上,复性后蛋白具有较高的生物学活性。结论已确定了rhOP-1包涵体梯度透析复性的最佳条件。     

重组人干扰素的研究进展

重组人干扰素(Recombinant human interferon,rhuIFN)是一类抗病毒、抗肿瘤和多发性硬化调节免疫的重要生物制品。自1957年发现干扰素以来,人们不断采用新技术对干扰素分子结构进行改造,先后研发了原型干扰素、保守干扰素、聚乙二醇修饰干扰素等几十个品种,目前已批准十余个一类新药干扰素上市。本文在回顾干扰素药物历史的基础上,对化学修饰改型干扰素、融合干扰素、杂合干扰素等的研究进展作一综述。     

重组人干扰素-β(rhIFN-β)中试工艺研究

目的　建立适合大规模生产重组人干扰素 β(rhIFN β)的分离纯化工艺。 方法　采用超声破菌、离心分离包涵体、仲丁醇萃取、Sephacryl 10 0、HIC层析等分离纯化步骤。结果　纯化的rhIFN β纯度达 98%以上 ,比活性为 2 .0× 10 7IU/mg,各项质量指标均符合质控标准。结论　此纯化工艺简便 ,可重复性好 ,适于大规模生产。     

重组人干扰素γ的分子结构及其生物活性

目的 了解重组人干扰素γ的分子结构及其生物活性。方法 采用细胞病变抑制法，以日本干扰素γ参考品为标准，计算国际单位。以4种不同方法检测相对分子质量。结果 比活性≥3．0×107 IU/mg蛋白，相对分子质量低于理论值16900。氨基酸分析结果只有129个氨基酸，少于应有数目。N端氨基酸序列分析结果，15－19个氨基酸与理论序列相符。结论 重组人干扰素γ C末端氨基酸有缺失，但不影响其生物活性。     

微波联合重组ɑ-2b人白细胞干扰素凝胶治疗尖锐湿疣疗效观察

目的探讨微波联合重组ɑ-2b人白细胞干扰素凝胶治疗尖锐湿疣疗效。方法对198例患者分组治疗,治疗组局部外用重组ɑ-2b人白细胞干扰素凝胶,对照组则不使用任何药物。结果治疗组中痊愈86例(86%),复发14例(14%);对照组治愈67例(68.37%),复发31例(31.63%)。两组复发率比较χ2=7.88,P<0.005,有显著差异性。结论微波联合重组ɑ-2b人白细胞干扰素凝胶外用治疗尖锐湿疣,治疗组的复发率明显低于对照组。     

表面活性剂辅助重组蛋白质复性

以重组人溶菌酶（rhLys）与重组β-甘露聚糖酶（rMan）为体系,综合采用活性测定、非还原性SDS-PAGE以及荧光发射光谱分析等方法研究了十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、CTAB与β-环糊精（β-CD）组成的人工分子伴侣以及其他种类复性助剂对重组蛋白质复性过程的影响.结果表明CTAB及人工分子伴侣均可有效地辅助rhLys复性,且rhLys与鸡卵清溶菌酶（Lys）呈现出类似的复性过程特性;人工分子伴侣可显著地提高rMan在高浓度下的复性率;表面活性剂带电性质、表面活性剂与蛋白质的摩尔比以及变性蛋白质的浓度等是影响复性率及复性产品分布的主要因素.这些结果对于此类复性技术应用于重组蛋白体系时的工艺选择和优化提供了重要的依据和参考.     

聚乙二醇修饰重组人干扰素-α1b条件的优化

目的对聚乙二醇(PEG)衍生物化学修饰重组人干扰素-α1b(rhIFN-α1b)的条件进行优化。方法以3种不同的第2代PEG衍生物对rhIFN-α1b进行修饰,SDS-PAGE分析PEG及修饰产物的表观相对分子质量。对反应pH值、温度、时间、修饰剂用量等修饰条件进行优化,并对修饰产物进行初步分离纯化和活性检测。结果PEG的电泳表观相对分子质量大于其理论值;PEG20000的修饰率(92.1%)高于PEG5000和PEG10000;修饰剂用量和pH值是主要影响因素,最佳pH为9.0,rhIFN-αlb与PEG20000的最佳摩尔比为1∶10,时间和温度影响甚微。单点修饰产物保留了14.4%的体外活性,多点修饰产物无活性。结论选择了合适的PEG衍生物并优化了修饰条件,为进一步深入研究奠定了基础。     

不同分子量聚乙二醇单修饰重组人干扰素a-2a

利用N-羟基琥珀酰亚胺活化制备不同分子量的聚乙二醇修饰剂(NHS-mPEG，分子量5000, 10000, 20000)，考察三者水解动力学性质的差异，结合正交实验确定了不同分子量修饰剂制备单条PEG链修饰重组人干扰素a-2a(rhIFN-a-2a)的最佳反应条件，用离子交换法对产物进行分离纯化. 研究了不同分子量聚乙二醇干扰素结合物的体外活性，比较其蛋白收率. 实验结果表明，修饰剂分子量增大，应选择蛋白与修饰剂的反应活性高的修饰反应条件，体外活性虽然降低，但同时单修饰聚乙二醇干扰素结合物收率更高，产品质量更易控制.     

重组人EC-SOD包涵体的稀释复性及重折叠后蛋白的纯化

目的确定重组人ECSOD包涵体体外稀释复性和复性后蛋白纯化的适宜方法。方法通过对pH、温度、包涵体蛋白浓度、尿素和精氨酸浓度及氧化还原对比率的定性定量分析,研究重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的基本条件。采用金属离子亲和柱(IMAC)和肝素亲和柱(Heparinsepharose)对复性蛋白进行纯化,比较纯化效率的差异。结果最佳复性条件为pH8.5,尿素浓度为1.5molL,精氨酸浓度大于0.3molL,GSH∶GSSG=4∶1;复性温度及包涵体蛋白终浓度越高,复性效率越低。IMAC和Heparinsepharose亲和柱均可用来纯化复性蛋白溶液,但Heparinsepharose纯化效率较高。结论确定了重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的最佳条件及复性后蛋白纯化的方法。     

可溶性重组人成骨蛋白-1的制备

目的制备可溶性重组人成骨蛋白-1(rhOP-1),并尝试制备注射制剂。方法rhOP-1工程菌经发酵表达,收集菌体,提取包涵体,用SP-FF阳离子层析柱纯化。取纯度达95%以上的rhOP-1蛋白,透析复性,加入L-精氨酸作为复性助溶剂,制备成冻干粉末,以不加助溶剂的rhOP-1为对照。将制备的冻干粉末复溶后,观察rhOP-1溶解性,并检测其活性。结果复性液中加入L-精氨酸的复性rhOP-1蛋白浓度为0.5mg/ml,回收率可达60%,冻干粉末复溶后,溶解性及rhOP-1活性良好。结论用此复性方法制备的rhOP-1溶液作为注射剂,有较好的应用前景。     

稀释复性法体外复性重组牛凝血酶原-2包涵体

对重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性进行了研究。凝血酶原-2是α-凝血酶生成过程中的一个最小的单链中间前体。重组牛凝血酶原-2在E.coli中高效表达并形成包涵体,经2.5mol?L?1脲和0.7%Triton X-100洗涤,再用8mol?L?1脲和0.3mol?L?1DTT溶解后,得到了包涵体裂解液。研究优化了体外复性溶液,其组成为含2.7mol?L?1脲、0.6mmol?L?1GSSG、GSSG/GSH0.9、0.1%PEG6000和0.5mol?L?1L-Arg、pH7.4Na3PO4缓冲液。牛凝血酶原-2复性后经透析,再被Echis Carinatus Snake Venom激活,转化为有活性的α-凝血酶,其总活力可达2948U?mL?1。结果表明稀释复性法可用于重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性。     

聚乙二醇-重组人干扰素α2b结合物冻干保护剂的筛选

目的筛选聚乙二醇-重组人干扰素α2b(PEG-rhIFNα2b)结合物的冻干保护剂。方法采用两步筛选法,以氨基酸、甘露醇和糖类作为冻干保护剂,与PEG-rhIFNα2b在适宜条件下制备成冻干制剂,分别于40、25和4℃放置不同时间取样,检测其理化性质和生物学稳定性,筛选最佳保护剂配比。结果通过6～12个月的试验,证实该冻干制剂外观、pH无明显改变,但再溶解速度略慢于以人血白蛋白作保护剂的冻干制剂;采用15mmol/L精氨酸+10mmol/L谷氨酸+4%甘露醇+1%蔗糖/海藻糖的冻干保护剂配方,在4℃和25℃放置12个月后,抗病毒活性仍较好,相当于人血白蛋白的冻干保护效果。结论已筛选出不含人血白蛋白的PEG-rhIFNα2b结合物的冻干保护剂。     

化学渗透法破碎基因重组E.coli提取重组人SOD包含体和复性

以化学渗透法破碎重组大肠杆菌细胞释放重组人超氧化物歧化酶(rhSOD)包含体并对其复性.选择四种化学试剂(Triton X-100、EDTA、NaOH和SDS)对rhSOD重组大肠杆菌细胞进行破碎实验,以SDS-PAGE检测破菌效果,结果0.5%Triton X-100和10 mmol·L-1 EDTA可以较好地破碎重...     

重组结核分枝杆菌11kDa蛋白皮肤试验与体外干扰素γ检测方法的比较

目的对重组结核分枝杆菌11k Da蛋白(以下简称重组11k Da蛋白)皮肤试验与体外干扰素γ(interferonγ,IFNγ)检测方法进行比较。方法选取32名健康志愿者进行重组11k Da蛋白和TB-PPD的同体双臂皮肤试验,分别于不同前臂皮内注射0.1 ml重组11k Da蛋白(10μg/ml)和0.1 ml TB-PPD(50 IU/ml),注射后24、48、72 h测量志愿者皮肤反应(硬结和红晕)的两个直径(最大径和最大径的垂直径),并取其均值。于皮肤试验前采集32名志愿者的静脉血,分离外周血单个核细胞,采用T-SPOT.TB试剂盒进行检测。比较重组11k Da蛋白皮肤试验与体外IFNγ检测结果的一致性。结果以注射72 h后的硬结反应统计重组11k Da蛋白皮肤试验中阳性人数为8名,阳性率为25%,TB-PPD皮肤试验中阳性人数为24名,阳性率为75%,其中强阳性人数为8名;体外IFNγ检测(T-SPOT.TB)阳性人数为7名,阳性率为22%。重组11k Da蛋白皮肤试验结果和体外IFNγ检测结果一致性良好(Fleiss Kappa值=0.913),这两种检测方法的阳性率远低于TB-PPD皮肤试验(Fleiss Kappa值=0.266)。结论重组11k Da蛋白皮肤试验的检测结果与体外IFNγ检测结果基本一致,有潜力成为结核分枝杆菌潜伏感染者的新筛查方法。     

重组人干扰素a1b联合5%氟尿嘧啶软膏治疗尖锐湿疣

目的观察重组人干扰素a1b联合5%氟尿嘧啶乳膏治疗尖锐湿疣的效果。方法将120例尖锐湿疣病例分为治疗组60例和对照组60例,治疗组采用5%氟尿嘧啶联合干扰素治疗,对照组单纯采用5%氟尿嘧啶治疗。结果以随访3个月为限,治疗组治愈率为96.7%,高于对照组的80.0%,P<0.01。结论重组人干扰素a1b联合5%氟尿嘧啶乳膏治疗尖锐湿疣能明显提高治愈率。