仿刺参补体类似物活性的测定

用3种方法对仿刺参Apostichopus japonicus体腔液、体腔液上清液及体腔细胞中的总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4活性进行测定。结果表明:在仿刺参体腔液、体腔液上清液和体腔细胞中能够检测到总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4,表明仿刺参体内存在有脊椎动物的补体类似物,且活性与正常人补体活性相似。仿刺参体内总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4的活性依次顺序均为体腔液>体腔细胞>体腔液上清液。     

仿刺参体腔液中酚氧化酶活性的分析

在(22±1)℃下抽取体质量为95.0～105.0 g的仿刺参Apostichopus japonicas体腔液,制备体腔液及体腔细胞溶解上清液(CLS),分别测定其酚氧化酶(PO)活性,检测分析不同刺激物(CaCl2、MgCl2、LPS、SDS、Trypsin和甲醇)对酚氧化酶原(proPO)系统的激活效果,并比较了不同规格仿刺参体腔液的酚氧化酶活性。结果表明:仿刺参体腔液中的PO活性个体差异较大,平均为(146.90±55.60)U,体腔液与不同激活剂作用后PO活性均无明显变化;CLS中的PO活性为31.82 U,其在100 mmol/L MgCl2作用后PO活性大幅度提高,proPO比活为43.9 U,CLS与LPS、CaCl2和甲醇作用后PO活性无明显增加,与SDS和Trypsin作用后PO活性表现出一定的抑制。研究表明,仿刺参体腔液中的PO主要存在于体腔液中,CLS中的PO活性较低,proPO主要存在于体腔细胞中,可被Mg2+大幅度激活。52.4～68.5、20.7～24.4、4.9～5.6 g 3种规格的仿刺参体腔液中的PO活性分别为(42.18±7.62)、(34.10±9.28)、(33.29±7.42)U,表明不同规格仿刺参体腔液中的PO活性存在一定差异,总体呈现随规格的增大PO活性增强的趋势,其中100 g左右的仿刺参与3个较小规格的仿刺参体腔液中的PO活性存在显著性差异(P<0.05)。     

饲料中不同类型的硒对仿刺参幼参生长和免疫指标的影响

在水温为13.0²0.0℃、盐度为31.020.0℃、盐度为31.0³2.0和pH为7.5的条件下,将初始体质量为5.3632.0和pH为7.5的条件下,将初始体质量为5.36⁵.57 g的仿刺参Apostichopus japonicus幼参放养在塑料水槽中(40 L),每箱15头,分别投喂在基础饲料中添加0.4 mg/kg硒粉、富硒酵母、蛋氨酸硒和亚硒酸钠的试验饲料,以未添加硒的基础饲料作为对照组,每个试验组设3个重复。60 d的饲养结果表明:摄食添加硒饲料的仿刺参的增重率、体壁的粗蛋白含量和对饲料中粗蛋白的表观消化率均显著高于对照组(P<0.05),其中摄食添加蛋氨酸硒一组的仿刺参增重最大,摄食添加富硒酵母的次之;摄食添加硒饲料的仿刺参体腔液中超氧化物岐化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性均高于对照组,但差异不显著(P>0.05),而摄食添加酵母硒组的仿刺参体腔液中酸性磷酸酶(ACP)的活性显著高于对照组(P<0.05)。饲料硒能促进仿刺参的生长,可能与提高饲料蛋白质的消化率有关;饲料硒能提高仿刺参的成活,可能与提高体腔中SOD、CAT和ACP的活性有关。试验表明,饲料中的有机硒能促进仿刺参对饲料蛋白质的消化和积累,进而促进其生长的效果优于无机硒。     

仿刺参不同组织液的抗菌活性

采用平板菌落计数法测定仿刺参Apostichopus japonicus体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液和体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌Vibrio harveyi的抑制作用,并对健康仿刺参与感染后仿刺参的体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用进行了比较;采用乙醇沉淀、离心等方法从仿刺参体壁内皮组织中粗提得到一种水溶性成分,测定了该成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌Staphylococcus albus和迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda的抑菌活性,并初步研究了该成分的基本性质。结果表明:仿刺参体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌的抑制效果显著,体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液对哈氏弧菌的抑制效果不显著;感染状态下,仿刺参体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用与健康状态相比有所降低。提取的水溶性成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌和迟钝爱德华氏菌均有明显的抑制作用;该成分的茚三酮反应呈阳性,其中蛋白质的质量分数为17.48%;该成分经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到5个蛋白条带,相对分子质量大约为55 300、46 100、34 700、19 500和14 500,初步认为其含有肽类抗菌活性物质。     

饲料中添加蛋氨酸硒对仿刺参幼参存活、生长及免疫指标的影响

在水温为14.0～8.0℃、盐度为31～32和pH为7.5的条件下,将初始体质量为1.30～1.68 g的仿刺参Apostichopus japonicus幼参饲养在塑料水槽(40 L)中,投喂蛋氨酸硒添加量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/kg的饲料60 d,每种饲料设3个重复,每个重复组放15头仿刺参。试验结束后饥饿24h,测定仿刺参体质量的特定生长率(SGR),体腔液中过氧化氢酶(SOD)、超氧化物歧化酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)的活力,体壁干物质和肠干物质中硒的含量。结果表明:各组仿刺参的成活率为100%;当蛋氨酸硒添加量为0.6 mg/kg时,仿刺参幼参的SGR最大,且显著高于对照组(P<0.05),当硒添加量为1.0 mg/kg时,仿刺参幼参的SGR值最小;当硒添加量为0.6 mg/kg时,仿刺参对饲料干物质和粗蛋白的表观消化率最高,且显著高于对照组(P<0.05);各试验组仿刺参体壁干物质中蛋白质含量均显著高于对照组(P<0.05),且当硒添加量为0.4 mg/kg时,蛋白质含量最高;当硒添加量为0.6 mg/kg时,幼参肠中的硒含量最高,且显著高于对照组(P<0.05),但当硒添加量为0.4 mg/kg时,幼参体壁中的硒含量最高,其次为0.6 mg/kg硒组;除硒添加量为1.0 mg/kg外,各试验组仿刺参体腔液中的SOD、CAT值均显著高于对照组(P<0.05),添加量分别为0.8 mg/kg和0.4 mg/kg时达到最高,其次是0.6 mg/kg组;各试验组仿刺参ACP的活性均显著高于对照组(P<0.05),硒添加量为0.4 mg/kg时达到最高。研究表明,仿刺参幼参饲料中蛋氨酸硒的适宜添加量为0.4～0.6 mg/kg。     

饲料中β-胡萝卜素和虾青素添加量对仿刺参幼参生长及抗氧化能力的影响

在水温11.0～20.0℃、盐度35、pH 7.5的实验室条件下,将初始平均体质量为3.89 g的仿刺参Apostichopus japonicus幼参放养在60 L的塑料水槽中,投喂添加30、60、90 mg/kgβ-胡萝卜素和虾青素的饲料,分别记为A、B、C、D、E、F组,以不添加此物质的基础饲料作为对照(G组),每组设3个重复,饲养80 d后测定幼参的生长和几种抗氧化酶的活性。结果表明:摄食添加β-胡萝卜素的饲料时,仿刺参的特定生长率随添加量的增加而升高,A、B、C组分别比对照组提高6.67%、73.33%和100.0%,但仅C组与对照组差异显著(P<0.05);摄食添加60 mg/kg和90 mg/kg虾青素的饲料时,仿刺参的特定生长率比对照组提高113.33%和66.67%,但仅E组与对照组差异显著(P<0.05);试验组仿刺参体腔液中的总抗氧化能力(T-AOC)随饲料中β-胡萝卜素和虾青素含量的增加而升高,除A、B组外其余各试验组均显著高于对照组(P<0.05),饲料中添加虾青素的各组仿刺参体腔液的平均总抗氧化能力(12.77 U/mL)比添加β-胡萝卜素的各组平均值(8.77 U/mL)高45.61%,表明虾青素的抗氧化能力高于β-胡萝卜素;C、E、F组仿刺参体腔液中的SOD和CAT活性均显著低于对照组(P<0.05),而A、B、D组与对照组差异不显著(P>0.05);试验组仿刺参肠道蛋白酶和淀粉酶活力及体壁成分较对照组均无显著差异(P>0.05)。     

不同形状的附着基对仿刺参幼参生长的影响

在水温为9.0～16.0℃下,将体质量为(0.5±0.2)g的仿刺参Apostichopus japonicus Selenka幼参饲养在放置了混凝土制的中空型(A类)、楼层型(B类)和井字型(C类)附着基的塑料水槽(45 cm×31 cm×30 cm)中,投喂配合饲料,采用每周清洗一次附着基(A1、B1、C1组)和不清洗附着基(A、B、C组)的方法饲养80 d,研究了附着基形状及其处理方式对仿刺参幼参生长的影响。结果表明:是否清洗对仿刺参的特定生长率有极显著性影响(P<0.01),附着基形状与是否清洗的交互作用对仿刺参的特定生长率有显著性影响(P<0.05),其中B1组仿刺参的特定生长率最高,B组最低,且两组之间有显著性差异(P<0.05);定期清洗附着基的各试验组水中氨氮和亚硝酸氮含量及化学耗氧量均低于不清洗组;不清洗附着基的各组仿刺参体腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LSZ)的平均活性分别比清洗组高32.28%、9.17%和5.71%,而相同形状附着基的不清洗组与清洗组仿刺参的SOD活性存在显著或极显著性差异(P<0.05、P<0.01)。     

复方中草药对仿刺参免疫力和抗病力的影响

将以黄芪、党参为主药并加入另外5味中草药所配伍的复方中草药粉碎制剂,以质量分数分别为0%(对照组)、0.5%、1.5%和2.5%的剂量添加于基础饲料中,连续投喂仿刺参Apostichopus japonicus37d,在试验开始后第1、2、3、4周采样,测定仿刺参的肠、触手、体壁、肌肉和体腔液中的抗菌活力及体腔细胞的吞噬活性;于试验开始后第4周,用仿刺参"化皮病"病原菌黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi以3.7×108个/mL的浓度在每头仿刺参背部注射0.1 mL的菌悬液,每天观察记录死亡个体症状,统计死亡率,计算相对保护率(共观察记录7 d)。结果显示:各组的抗菌活力均随着用药时间的延长、用药浓度的加大而升高,总体趋势表现为2.5%添加组>1.5%添加组>0.5%添加组>对照组;各用药组仿刺参的体腔细胞吞噬能力均随着用药时间的延长呈现先升高后降低的趋势,第2、3周达峰值,总体趋势表现为1.5%添加组>2.5%添加组>0.5%添加组>对照组;攻毒试验结果显示,对照组仿刺参3 d后全部死亡,第7天各用药组相对保护率依次为1.5%添加组>0.5%添加组>2.5%添加组,分别为30.0%、20.0%和10.0%。由此表明,该复方中草药可以显著提高仿刺参的免疫力和抗病力,以1.5%添加剂量组的效果最佳。     

异戊二烯对刺参急性毒性及其抗氧化酶和免疫酶活性的影响

为研究有机污染物对海洋生物的毒性影响,选择海洋环境中典型的异戊二烯作为暴露污染物,研究其对体质量为(5.23±0.96)g刺参Apostichopus japonicus的急性毒性及其体腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性的影响,并在实验室条件下,采用静水式生物毒性试验法开展了急性毒性试验,以及96 h亚致死效应的毒性试验。结果表明:异戊二烯对刺参的24、48、72、96 h半致死质量浓度分别为83.00、78.09、72.93、69.77 mg/L,安全质量浓度为6.98 mg/L;亚致死试验中,CAT活性受到的影响最大,表现为受到抑制作用,存在良好的剂量-效应和时间-效应正相关性;96 h时,中、低浓度异戊二烯对SOD活性具有显著的诱导作用(P<0.05),而高浓度异戊二烯对SOD活性具有极显著的抑制作用(P<0.01);ACP和AKP活性受到的影响较小,但48 h时两种酶均受到极显著的诱导作用(P<0.01),96 h时AKP活性受到显著的诱导作用(P<0.05);随着异戊二烯质量浓度的增加和时间的延长,刺参体腔液中4种酶活性受到不同程度的影响,因此,异戊二烯胁迫对刺参体内产生自由基导致氧化胁迫效应,以及对消化、能量代谢系统的影响可能是其重要的致毒原因,刺参体腔液中4种酶的变化体现了异戊二烯的致毒机制。本研究结果可为异戊二烯对海洋生物的生态毒理学方面的研究提供参考依据。     

仿刺参体腔细胞原代培养方法初探

以仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞为材料,分别用体腔液和MEM、L-15两种培养基进行原代培养,初步探讨了仿刺参体腔细胞培养的基本条件。结果表明:在18℃下封闭培养,体腔细胞在体腔液中直接培养能够贴壁、伸展,细胞呈球形和上皮样,但凝集现象严重;在合成培养基(MEM、L-15)中,体腔细胞凝集明显减少;与MEM培养基相比,体腔细胞在L-15培养基中贴壁时间长,伸展状态好,上皮样细胞较多,可培养至72 h;培养基中血清的添加量与细胞的培养状态和可培养时间关系不明显。