刺参补体AjC3活性相关miRNA的筛选与初步研究

为了从miRNA调控方面探索刺参Apostichopus japonicus的免疫机制,用脂多糖刺激刺参,在第0、6、12 h取样(记为样本A00、A06、A12),以海胆Strongylocentrotus purpuratus基因组为参照基因,运用高通量测序和相关生物信息学方法筛选与刺参补体(AjC3)相关的miRNAs,并通过实时定量PCR验证相关miRNA和AjC3 mRNA的表达变化。结果表明:经比对筛选出刺参体腔细胞的miRNA共41个;通过靶基因预测和差异表达分析,共得到靶基因为补体AjC3的miRNA有3个,分别为spu-miR-133、spu-miR-137、spu-miR-2006;3种miRNA和AjC3 mRNA实时定量PCR显示,spu-miR-133表达量呈先升高后降低的趋势,12 h达到最高值,spu-miR-137表达量呈先降低后升高的趋势,9 h达到最低值,12 h达到最高值,spu-miR-2006表达量呈先升高后降低的趋势,9 h达到最高值,AjC3 mRNA表达量呈先升高后降低的趋势,9 h达到最高值。研究表明,spu-miR-133、spu-miR-137可能共同抑制调控补体AjC3基因表达,spu-miR-2006在免疫反应中对其他靶基因进行调控。     

4种壳色菲律宾蛤仔在低氧胁迫下的耐受能力比较研究

菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum对环境中溶氧剧烈的波动有较强的适应能力,为了探讨抗氧化酶和热休克蛋白在蛤蛤恣仔的低氧耐受过程中发挥的作用,以对低氧具有不同耐受能力的4种壳色蛤仔(野生蛤仔、斑马蛤、白蛤、白斑马蛤)为研究对象,比较了在1 mg/L的低氧胁迫条件下其抗氧化酶家族基因成员(TPx、CAT、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD)和热休克蛋白家族基因成员(HSP40、HSP75、Vps HSP-1、Vps HSP-2)的表达量变化情况。结果表明:在鳃组织中,野生蛤仔的抗氧化酶基因表现出先升高后恢复的趋势,在胁迫后6 h时表达量达到最高值(P<0.05),其他3种壳色蛤仔的抗氧化酶基因表现出先降低后恢复的趋势,在胁迫后6 h时表达量达到最低值(P<0.05),斑马蛤的TPx基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05);在外套膜组织中,4种壳色蛤仔中的抗氧化酶基因均表现出先升高后恢复的趋势,白蛤TPx基因和白斑马蛤CAT基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05);在鳃组织中,斑马蛤和白斑马蛤中热休克蛋白家族基因成员表现出先降低后升高再降低的趋势,分别在24 h、6 h时达到最低值(P<0.05),野生蛤仔和白蛤中热休克蛋白家族基因成员表现出先升高后降低的趋势,在胁迫6 h时,白蛤热休克蛋白家族基因成员表达量达到最高值(P<0.05),胁迫12 h时,野生蛤仔达到最高值(P<0.05);在外套膜组织中,白斑马蛤中热休克蛋白家族基因成员表达量出现先降低后升高的趋势,在胁迫6 h时达到最低值(P<0.05),而其他3个壳色蛤仔中热休克蛋白家族基因表达量表现出先升高后降低的趋势,在胁迫6 h时野生蛤仔和白蛤热休克蛋白家族基因成员表达量达到最大值(P<0.05),12 h时斑马蛤达到最大值(P<0.05),且白蛤HSP40基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05)。研究表明,斑马蛤和白蛤的TPx基因可能参与其体内黑色素合成的过程,初步证实了不同壳色蛤仔参与色素合成过程的相关基因在其对低氧的耐受过程中能够发挥重要作用。     

4种壳色菲律宾蛤仔在低氧胁迫下的耐受能力比较研究

菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum对环境中溶氧剧烈的波动有较强的适应能力,为了探讨抗氧化酶和热休克蛋白在蛤蛤恣仔的低氧耐受过程中发挥的作用,以对低氧具有不同耐受能力的4种壳色蛤仔(野生蛤仔、斑马蛤、白蛤、白斑马蛤)为研究对象,比较了在1 mg/L的低氧胁迫条件下其抗氧化酶家族基因成员(TPx、CAT、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD)和热休克蛋白家族基因成员(HSP40、HSP75、Vps HSP-1、Vps HSP-2)的表达量变化情况。结果表明:在鳃组织中,野生蛤仔的抗氧化酶基因表现出先升高后恢复的趋势,在胁迫后6 h时表达量达到最高值(P<0.05),其他3种壳色蛤仔的抗氧化酶基因表现出先降低后恢复的趋势,在胁迫后6 h时表达量达到最低值(P<0.05),斑马蛤的TPx基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05);在外套膜组织中,4种壳色蛤仔中的抗氧化酶基因均表现出先升高后恢复的趋势,白蛤TPx基因和白斑马蛤CAT基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05);在鳃组织中,斑马蛤和白斑马蛤中热休克蛋白家族基因成员表现出先降低后升高再降低的趋势,分别在24 h、6 h时达到最低值(P<0.05),野生蛤仔和白蛤中热休克蛋白家族基因成员表现出先升高后降低的趋势,在胁迫6 h时,白蛤热休克蛋白家族基因成员表达量达到最高值(P<0.05),胁迫12 h时,野生蛤仔达到最高值(P<0.05);在外套膜组织中,白斑马蛤中热休克蛋白家族基因成员表达量出现先降低后升高的趋势,在胁迫6 h时达到最低值(P<0.05),而其他3个壳色蛤仔中热休克蛋白家族基因表达量表现出先升高后降低的趋势,在胁迫6 h时野生蛤仔和白蛤热休克蛋白家族基因成员表达量达到最大值(P<0.05),12 h时斑马蛤达到最大值(P<0.05),且白蛤HSP40基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05)。研究表明,斑马蛤和白蛤的TPx基因可能参与其体内黑色素合成的过程,初步证实了不同壳色蛤仔参与色素合成过程的相关基因在其对低氧的耐受过程中能够发挥重要作用。     

刺参多功能表皮生长因子6(megf6)cDNA克隆及在肠再生过程中的表达分析

为了探究刺参Apostichopus japonicus多功能表皮生长因子6(multiple epidermal growth factor 6)的生物学信息和功能,利用RACE技术克隆了体质量为(92.0±4.0)g的成体刺参megf6基因(Aj-megf6)cDNA全长序列,并分析了该基因的信息学特征及其在肠再生过程中表达水平的变化。结果表明:刺参megf6基因的cDNA序列全长为5665 bp,共编码了1604个氨基酸,具有37个EGF样结构域;该基因编码蛋白的相对分子质量为172 500,理论等电点为4.74,该蛋白具有信号肽,为分泌蛋白,属于亲水性、非跨膜蛋白,共有53个磷酸化位点,分别为23个Ser位点、12个Thr位点、18个Tyr位点;MEGF6氨基酸多序列比对发现,刺参MEGF6与其他物种的氨基酸序列一致性为38.59%～49.07%,其中与紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus的一致性最高,为49.07%,其次为长棘海星Acanthaster planci(48.71%);基于MEGF6氨基酸序列的系统进化树分析显示,刺参与紫球海胆、长棘海星聚为一支,该结果符合刺参的分类和进化地位,MEGF家族成员间比对分析显示,MEGF家族成员间具有一定的分化;实时定量PCR (qPCR)结果显示,在刺参肠再生过程中megf6 mRNA表达量呈先升高后降低的趋势,其中再生6 d时的表达量达到峰值,为对照组的126.47倍,再生18 d时降至正常水平。研究表明,刺参megf6基因的表达与刺参肠管形态的变化趋势相一致,推断megf6可能在刺参肠再生过程中发挥重要作用。     

低盐胁迫下仿刺参DD104基因的定量表达分析

以2龄仿刺参Apostichopus japonicus为试验材料,利用实时定量PCR技术分析了DD104基因在仿刺参不同组织中以及低盐胁迫后不同时间的表达情况。结果表明:DD104基因在仿刺参管足中的表达水平最高,在体腔液、触手、呼吸树中的表达水平次之,在体壁、肌肉和肠中的表达水平较低;仿刺参在受到低盐胁迫后,体内DD104 mRNA的表达随盐度胁迫时间的增加呈现波动性增减,胁迫72 h时DD104基因的表达最强,在肌肉和管足中的表达量达到最大;胁迫48 h时肠组织中的表达量最大;胁迫24 h时体腔液中的表达量最大。研究表明,低盐胁迫后DD104基因在仿刺参不同组织中的表达发生变化的时间点不同,低盐胁迫下DD104基因表达量的变化规律说明该基因的表达可能与渗透胁迫密切相关。     

急性温度胁迫对虹鳟肝脏代谢酶活性及生长相关基因表达的影响

为探究急性温度胁迫对虹鳟Oncorhynchus mykiss肝脏代谢酶和部分生长调控基因表达的影响,采用血清生化分析仪测定了低温(6℃)和高温(24℃)胁迫下虹鳟(体质量为240 g±18 g)血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)的活性,通过放射免疫法测定了血清类胰岛素生长因子1(IGF-1)的含量,采用实时定量法测定了肝脏中GHR1、IGF-1和IGF-2的表达量。结果表明:温度胁迫2 h后,低温和高温两个处理组鱼的AST活性和高温组的ALT活性均呈先升高后降低的趋势,均在恢复6 h时达到最大值,而低温组鱼的ALT活性在胁迫后恢复0 h时就显著升高(P<0.05),随后逐渐降低至对照组水平;低温组鱼的ALP活性在胁迫后显著降低(P<0.05),并在48 h的恢复期间始终维持在较低水平,而高温组鱼的ALP活性比对照组略有降低(P>0.05);低温组鱼的血清IGF-1激素含量在恢复12 h后呈上升趋势,并在48 h时恢复至对照组水平,而高温组血清IGF-1含量在胁迫后始终处于较低水平;两个处理组肝脏中,GHR1基因表达量比对照组略有降低(P>0.05),而IGF-1和IGF-2基因表达量均呈先降低后升高的趋势,且IGF-2表达量下降更明显,并在恢复12 h时达到最低值。研究表明:温度胁迫后,虹鳟血清转氨酶活性降低,肝脏受到损伤;血清IGF-1激素含量下降,肝脏中GHR1、IGF-1和IGF-2基因表达量均低于对照组;高温组各指标变化较大,说明属于冷水鱼类的虹鳟受高温影响更为显著。     

仿刺参ghitm基因的克隆及LPS诱导后的表达分析

根据GenBank中登录的仿刺参Apostichopus japonicus ghitm基因的EST片段,采用RACE扩增法克隆了仿刺参ghitm基因的c DNA全长序列,并利用qRT-PCR技术检测了经LPS诱导后仿刺参ghitm的表达变化情况。结果表明:仿刺参ghitm基因(Aj-ghitm)的c DNA序列全长为1325 bp,包含一个1005 bp编码334个氨基酸的开放阅读框,序列两端分别为140 bp的5'UTR和180 bp的3'UTR。序列分析结果显示,Aj-ghitm编码的蛋白含有一个8次跨膜结构域,与Gen Bank中登录的紫色球海胆GHITM蛋白的氨基酸序列相似度为65.4%,且在系统发育树中聚为一支;qRT-PCR检测结果表明,经LPS刺激可诱导仿刺参体腔细胞Aj-ghitm mRNA的表达且呈先下降后升高最后回复到接近正常水平的趋势,在24 h时上升到最高,随后下降。本研究是有关棘皮动物ghitm基因的首次报道,其结果可为进一步探讨ghitm在仿刺参抗细菌感染以及生长发育等方面的功能及作用机制提供参考。     

痛风泰颗粒对TOLL样受体基因TLR2、TLR3的调控作用

目的:分析痛风泰颗粒剂对Toll样受体基因TLR2、TLR3的调控作用,进而为解释该药物治疗痛风的作用机制提供理论依据。方法:首先痛风大鼠造模,获得原代炎性关节滑膜细胞。其次,将15只正常的SD大鼠随机分为生理盐水组,戴芬溶液组,低剂量、中剂量、高剂量痛风泰颗粒组,制备5种含药血清。最后,分别用上述5种血清刺激培养的炎性关节滑膜细胞,8 h后检测5组细胞TLR2和TLR3基因mRNA的表达。结果:经过不同条件的刺激后,TLR2基因只有中剂量痛风泰颗粒组的mRNA相对表达量与生理盐水组比较,具有显著差异(P<0.05),但总体趋势不明显;TLR3基因的mRNA相对表达量无任何趋势及表达差异(P>0.05)。结论:Toll样受体基因TLR2和TLR3可能并不是痛风泰颗粒剂治疗痛风的关键基因,更有价值的靶基因或调控因子有待于被发现。     

miRNA失调控与肿瘤的发生发展

<正>microRNA(miRNA)为长度约19～25个核苷酸的非编码RNA,miRNAs能够识别特定的目标mR-NA并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和/或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的作用[1]。计算机预测表明,每个miRNA有能力调控约200个靶基因,说明人类大约1/3的基因表达受miRNAs的精细调节。它们主要通过调节信号分子(细胞因子、生长因子、转录因子和促凋亡或抗凋亡基因等)的表达参与动植物的生长、发育、分化和代谢[2]。近几年来的研究发现,一些miRNA的特异性调节和     

不同温度胁迫对青鳉鳃凋亡的影响

为探究温度胁迫对青鳉Oryzias latipes鳃凋亡的影响,通过TUNEL(原位末端标记法)染色技术和流式细胞术检测了不同温度(高温35、40℃,低温10、4℃)胁迫下鳃的凋亡程度和活性氧(ROS)含量,并采用qPCR技术检测了促凋亡基因caspase3、caspase9、p53和抑凋亡基因caspase1、bcl2的表达量。结果表明:在35、40℃胁迫12 h的高温胁迫条件下,青鳉鳃细胞与正常温度组(26℃,对照组)相比均出现凋亡现象(P<0.05),且在40℃胁迫12 h时凋亡最为显著(P<0.01),细胞凋亡率为21.78%,ROS含量随温度升高呈显著上升趋势(P<0.05),促凋亡基因caspase3、caspase9、p53的表达随温度升高显著上升(P<0.05),抑凋亡基因caspase1和bcl2随之显著降低(P<0.05);在10、4℃胁迫12 h的低温胁迫条件下,青鳉鳃细胞也出现凋亡现象,且在4℃胁迫12 h时出现显著凋亡(P<0.01),凋亡率为24.79%,鳃细胞ROS含量随温度降低显著上升(P<0.05),促凋亡基因caspase3、caspase9、p53的表达量在10℃胁迫12 h时较对照组升高不明显(P>0.05),但在4℃胁迫12 h时较对照组极显著升高(P<0.01),抑凋亡基因caspase1和bcl2表达量随温度降低表现出先降低后升高趋势。研究表明,高温和低温胁迫均会使青鳉鳃发生不同程度的氧化应激,并产生大量ROS,诱导鳃组织发生凋亡,鱼鳃在极限温度胁迫下细胞的凋亡程度会影响鱼的存活时长,本试验结果为探索鱼类在极限温度下致死机制研究提供了科学参考。