4种扇贝AFLP分析体系的建立

构建了4种扇贝扩增片段长度多态性(AFLP)的分析体系,对DNA提取、双酶切反应、连接反应、预扩增反应、选择性扩增反应和银染等条件进行了优化。结果表明:用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切,核心序列加3个选择性碱基的选择性扩增引物,E32-M49和E32-M62两个引物组合,以及20μL选择性扩增体积,可得到十分稳定的结果。所得产物经电泳和银染后可获得条带清晰、背景干扰小的图像。该体系的构建为AFLP技术在扇贝相关研究中的应用提供了依据。     

人工养殖鲶的TRAP遗传分析

建立了鲶Silurus asotus的TRAP-PCR反应体系,采用24个TRAP引物组合对鲶人工选育群体进行引物适用性的研究,将获得的多态性位点用于研究鲶群体的遗传结构。结果表明:有9个引物组合可产生有效位点,其中多态引物占所筛选引物总数的37.5%,平均每条引物扩增出15个位点。共扩增出135个位点,多态位点数为75,多态位点比例为55.56%。说明TRAP标记技术适用于鲶的遗传多样性研究,可以作为构建鲶遗传连锁图谱的分子标记。     

泥鳅MSAP技术反应体系的建立及优化

为获得不同倍性泥鳅基因组DNA甲基化水平及模式,以泥鳅Misgurnus anguillicaudatus为研究对象,利用正交试验建立了甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法的反应体系,并利用该方法对二倍体泥鳅鳍基因组DNA进行了MSAP分析。结果表明:最佳双酶切反应体系为800 ng的泥鳅基因组DNA,用EcoR I、Hpa II和Msp I各10 U,在37℃下反应8 h后即可酶切;最佳预扩增反应体系为模板4μL、预扩增引物0.8μL、0.2 mmol/L d NTPs、1.5 mmol/L Mg2+和Taq 1 U;最佳选择性扩增反应体系为预扩增产物稀释20倍的模板2μL、引物1.5μL、0.375 mmol/L d NTPs、1.5 mmol/L Mg2+和Taq 1 U;二倍体泥鳅全甲基化率分别为24.1%、20.8%、22.3%,半甲基化率分别41.4%、20.8%、33.3%,总甲基化率分别为65.5%、41.6%、55.6%。研究表明,该反应体系稳定、可靠、重复性好,为MSAP技术在多倍体泥鳅相关研究中的应用奠定了基础。     

养殖大口黑鲈的遗传多样性分析

用RAPD技术分析了广东养殖大口黑鲈Micropterus salmoides3个群体基因组DNA的多态性。结果表明:用12条随机引物对3个群体共88尾大口黑鲈的基因组DNA进行扩增,共获得了106个位点,平均每条随机引物扩增出8.8个位点;广州群体、顺德大良群体和顺德南水群体的多态位点比例分别为32.08%、33.02%和40.57%;Nei遗传多样性指数分别为0.1151、0.1176和0.1627;Shannon s遗传多样性指数分别为0.1708、0.1742和0.2378。这表明目前广东地区养殖大口黑鲈种质资源还具有一定的遗传多样性,但养殖群体的遗传多样性在降低,且具有不同程度的种质退化。     

松江鲈群体遗传多样性的AFLP分析

利用AFLP分子标记技术对辽宁鸭绿江水域丹东段和河北秦皇岛渤海海域两个松江鲈Trachidermus fasciatus群体的遗传多样性进行分析研究。结果表明:用6对选择性引物,从两个群体的63个个体共扩增出360个位点,多态位点214个;松江鲈丹东和秦皇岛两群体的多态位点比率为50.28%、50.00%,平均杂合度和Shannon s指数分别为0.1690、0.1733和0.2534、0.2592,说明两个群体遗传多样性在同一水平上;Shannon s指数和AMOVA分析均显示松江鲈的遗传变异主要来自于群体内个体间,而群体间无明显的遗传分化;松江鲈UPGMA系统树没有依据群体分别聚类,未出现明显分支,无明显遗传差异;群体的显性基因型频率分布显示两个群体的遗传结构相似。     

光棘球海胆CYP17基因的SNPs标记筛选及遗传分析

采用聚合酶链式反应、单链构象多态性(PCR-SSCP)技术和基因测序方法筛选光棘球海胆Strongylocentrotus nudus细胞色素17α羟化酶/17,20裂解酶(17α-hydroxylase/17,20-lyase,CYP17)基因编码区单核苷酸多态性(SNPs),并进行了基于SNPs的遗传分析。结果表明:在CYP17基因的270、417、666 nt处均发生了碱基的点突变,即G270A、A417G和C666T,前两个突变位点位于引物对BF/BR的扩增产物中,后一个突变位点位于引物对CF/CR的扩增产物中;引物对BF/BR的扩增产物可形成3种基因型,即AA、BB和AB基因型,A和B等位基因频率分别为0.54和0.46,AA、AB和BB基因型频率分别为0.30、0.48和0.22,该座位的杂合度(He)、纯合度(Ho)、多态性信息含量(PIC)和有效等位基因数(Na)分别为0.496 8、0.503 2、0.373 4和1.987 3;引物对CF/CR的扩增产物形成了两种基因型,即CC和CD基因型,C和D等位基因频率分别为0.68和0.32,CC和CD基因型频率分别为0.84和0.16,该座位的He、Ho、PIC和Na分别为0.268 8、0.731 2、0.232 7和1.367 6。遗传变异分析结果表明:两个座位均属于低度多态性,而且群体遗传杂合度较低,这反映了该群体的遗传一致性较高。本研究筛选的3个SNPs为今后CYP17基因在光棘球海胆性腺生长发育研究上提供了前期科研基础。     

粉尘螨第十六类变应原的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的 获得大量具有良好IgE结合活性的粉尘螨第十六类变应原（Der f16）的重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究.方法 挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知Der f16基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Der f16基因片段,产物连入pMD32-T载体中.扩增后,利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切将目的 基因片段连接到pET32a表达载体上,转化到大肠杆菌（E.coli BL21）中经IPTG诱导表达.表达载体经亲和层析纯化,SDS-PAGE检测蛋白纯度,Western bolt检测变应原免疫学活性.结果 以粉尘螨总RNA为模板成功克隆出Der f16基因,与数据库中Der f16基因同源性为100%;经IPTG诱导后,大肠杆菌大量表达Der f16蛋白,所获得的重组蛋白分子质量为73 ku,上清及沉淀物均有蛋白表达,且上清表达量高于沉淀物.重组Der f16能够与螨过敏患者血清中的IgE 反应,而不与健康者血清中的IgE反应.结论成功构建了Der f16的原核表达载体,并高效表达和纯化出具有免疫原性的Der f16重组蛋白.     

菲律宾蛤仔SRAP标记体系的建立及不同壳色品系的遗传学分析

首次建立并优化了菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum SRAP分子标记技术体系,并利用17对引物组合对经过连续选育的白蛤、橙蛤和墨蛤3个菲律宾蛤仔品系进行了分子标记分析。结果表明:3个品系蛤仔共扩增出510个位点,白蛤品系的Nei指数和Shannon指数均显著高于墨蛤和橙蛤品系(P<0.05);遗传分化指数(Gst)为0.000 1～0.644 8,平均为0.046 7,表明有4.67%的变异存在于群体间,95.33%的变异存在于群体内;基因流(Nm)为0.275 4～2 000,平均每个位点的Nm为10.202 7;白蛤和墨蛤品系间的遗传距离最近(0.028 2),白蛤和橙蛤品系间的遗传距离最远(0.039 6)。研究结果表明,白蛤、橙蛤和墨蛤3个蛤仔品系间有很强的基因交流,遗传分化程度较弱,提示蛤仔品种的人工选育工作需持续进行。     

“光合1号”中华绒螯蟹微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选

采用磁珠富集法(Fast isolation by AFLP sequences containing repeats,FIASCO)构建"光合1号"新品种中华绒螯蟹Eriocheir sinensis基因组微卫星文库。用PCR法对225个单菌落进行鉴定,共获得168个阳性克隆,测序发现有94个含有微卫星座位,其准确率为55.95%,其中单元重复次数为5～10的序列占34.04%,重复次数为10～20的序列占20.21%,重复次数大于20的序列占45.75%,重复次数最高达到92次;完美型微卫星座位69个(占73.40%),非完美型微卫星座位17个(占18.09%),混合型微卫星座位8个(占8.51%);根据微卫星侧翼序列设计并合成53对引物,检测结果显示,有31对(占58.50%)引物能够扩增出特异性条带;选择其中14对多态性良好的引物用于中华绒螯蟹辽河野生群体的遗传多样性分析,共检测到148个等位基因,单个位点等位基因数为7～13个,平均为10.6个,观测杂合度为0.214 3～0.666 7,期望杂合度为0.825 4～0.910 1,多态性信息含量为0.766 3～0.865 4。     

金乌贼微卫星标记开发及两个野生群体遗传多样性比较

为进一步了解金乌贼Sepia esculenta野生群体遗传多样性水平,采用磁珠富集法从金乌贼基因组中开发了微卫星标记,并应用青岛(QD)金乌贼野生群体对其多态性进行评价,进而比较了青岛和长江口(CJK)两个野生群体的遗传差异。结果表明:开发标记的种群遗传学评价显示,在269个克隆子中,有192个含有微卫星序列(71.38%),基于该序列设计85对引物,其中20对通过筛选,完美型占60%,非完美型占10%,复合型占30%;经群体验证,表观等位基因数(A)为2～17不等,平均为8.15,观测杂合度(H_O)分布范围为0.146～0.936,平均为0.630,期望杂合度(H_E)分布范围为0.172～0.930,平均为0.702;其中5个位点不符合哈迪—温伯格(Hardy-Weinberg)平衡预期,存在零等位基因可能是其偏离平衡的原因;应用本研究开发的引物对2个近源种扩增,开发的20个标记位点中有6个在针乌贼Sepia andreana中表现为多态,4个位点在曼氏无针乌贼Sepiella maindroni中表现为多态;应用开发的11个位点对青岛和长江口两个野生群体进行遗传差异分析显示,所有位点中,青岛群体共检测到163个等位基因,长江口群体共检测到152个等位基因,每个位点的等位基因数为5～28和6～26不等,平均等位基因数分别为14.818和13.818;青岛群体独有等位基因19个,观测杂合度分布范围为0.250～0.936,平均为0.731,期望杂合度分布范围为0.265～0.930,平均为0.771,多态信息含量为0.223～0.946,平均为0.746;长江口群体独有等位基因8个,观测杂合度分布范围为0.500～0.896,平均为0.731,期望杂合度分布范围为0.623～0.960,平均为0.857,多态信息含量为0.614～0.948,平均为0.845;群体间遗传分化较弱(F_(st)值为0.032 5),群体分配分析结果表明,两个种群中所有个体正确分配到各自种群的概率分别为86.4%和84.0%。研究表明,本试验中开发的微卫星标记位点多样性水平略低于前人的研究,但有一定的跨种扩增通用性,长江口群体多样性水平略高于青岛群体,尽管两个群体间遗传分化程度不高,但存在明显差异。     

尖吻细鳞鲑胚胎及仔、稚、幼鱼发育的研究

通过活体观察和Bouin's液固定对乌苏里江尖吻细鳞鲑Brachymystax lenok的胚胎及仔、稚、幼鱼的发育进行观察,确定尖吻细鳞鲑的发育过程,详细描述了胚胎各发育时期的时序、形态特征以及仔、稚、幼鱼的发育特点,并将尖吻细鳞鲑与其它几种鱼类进行比较,探讨破膜所需时间与卵子性质和孵化水温的关系。结果表明:尖吻细鳞鲑成熟卵呈淡黄色,圆球形,卵径为(4.32±0.21)mm,含有大量卵黄,卵的比重大于水,属端黄卵,卵膜厚,无黏性,有弹性;受精卵在水温6.0¹0.7℃条件下,历时597 h孵出,有效积温为190.79℃.d;尖吻细鳞鲑胚胎发育过程包括受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官形成等6个阶段、26个发育时期。初孵仔鱼全长为(10.67±0.02)mm,破膜第13天仔鱼出现鳔并开始上浮,第14天仔鱼卵黄囊吸收完全,仔鱼期结束,进入稚鱼期;破膜后第25天稚鱼体侧出现幼鲑斑,第35天各鳍发育完全,进入幼鱼期,此时鱼体外观与成鱼无异。     

细鳞鱼气单胞茵的分离、鉴定及药敏试验

从患病细鳞鱼Brachymystax lenok体内分离出两种菌株(记为BAS和BAH),均属于革兰氏阴性短杆菌,无芽孢,无荚膜,多数呈单个排列,极端有单鞭毛。对两种菌株的菌落形态鉴定结果表明:BAS的菌落呈圆形,为浅黄色,半透明,无水溶性色素;BAH的菌落也呈圆形,中央微高,为灰白色。经API20NE细菌生化鉴定,BAS和BAH菌株分别为温和气单胞菌Aeromonas sobria和嗜水气单胞菌A.hydrophila,其鉴定率分别为98.1%和99.3%。注射剂量为1×10⁷CFU/mL时表现出较强的致病性,感染12 d时,细鳞鱼的死亡率为100%。药物敏感试验结果表明:两种菌株对妥布霉素(TOB)、四环素(TET)、庆大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、氟哌酸(NOR)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)高度敏感;对呋喃唑酮(FUR)、呋喃那斯、氯霉素(CHL)、复方新诺明(TST)中度敏感;对阿奇霉素(AZI)、红霉素(ERY)不敏感。     

哲罗鲑、细鳞鲑及其杂交种肌肉的营养成分分析

以体质量为38.03⁵5.03 g的哲罗鲑Hucho taimen、细鳞鲑Brachymystax lenok及其杂交种为研究对象,对其肌肉营养成分和氨基酸组成进行了分析评价。结果表明:3种鱼的粗脂肪含量差异显著(P<0.05),杂交种的水分、粗灰分含量高于哲罗鲑低于细鳞鲑,而粗蛋白质含量高于两者;杂交种的人体必需氨基酸和氨基酸总量均高于哲罗鲑和细鳞鲑,而鲜味氨基酸含量低于哲罗鲑高于细鳞鲑;3种鱼的必需氨基酸总量均高于FAO/WHO标准和鸡蛋蛋白标准,以杂交种最高;杂交种的氨基酸评分、化学评分和必需氨基酸指数均远高于哲罗鲑和细鳞鲑,以细鳞鲑最低。研究表明,3种鱼肉质鲜美,营养价值均较高,尤其是杂交种,其肌肉品质更优于哲罗鲑和细鳞鲑,这为哲罗鲑和细鳞鲑的杂交育种提供了参考。