梅毒螺旋体重组蛋白Tp0608的表达与鉴定

目的表达梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0608(rTp0608)并鉴定其抗原性,为深入探讨其在梅毒血清学诊断中的价值奠定基础。方法 PCR扩增Tp0608全长基因,构建原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608,转化宿主菌诱导表达rTp0608,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,SDS-PAGE分析蛋白表达形式与纯度,Western blot鉴定rTp0608的抗原性。结果原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608在宿主菌内经诱导表达了分子量大约为38 kDa的重组蛋白,以包涵体表达形式为主,纯化蛋白的纯度>95%;Western blot结果显示纯化蛋白能被梅毒患者混合血清特异性识别。结论 PET-28a(+)表达载体高效表达了rTp0608,该重组抗原有良好的抗原性。     

C11orf17蛋白的原核表达及功能预测

目的利用基因工程技术获取原核表达的C11orf17蛋白,结合生物信息学初步预测其功能。方法以K562细胞的cDNA为模板,PCR扩增C11orf17的基因序列;双酶切后将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a上,将测序正确的重组表达质粒pET-32a-C11orf17转化到E.coli BL21,经诱导后SDS-PAGE及Western blot检测融合蛋白表达,并分析其可溶性。采用UGET软件预测C11orf17共表达基因,蛋白质互作数据库挖掘C11orf17基因已知互作蛋白,在线软件Gather富集共表达基因生物功能。结果成功构建重组表达质粒pET-32aC11orf17,此重组体经诱导后能在E.coli BL21高效表达C11orf17的融合蛋白,UGET分析C11orf17前300共表达探针中,包含267个已知基因,共表达基因主要富集细胞交流、信号传导、细胞周期基因功能本体。蛋白互作数据库表明,C11orf17与PRKACA蛋白互作,后者为细胞周期调控重要分子。结论在原核细胞中成功表达出C11orf17蛋白,生物信息预测其可能是细胞周期调控重要新分子,为后续研究提供了方向和线索。     

罗非鱼热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达与纯化

以尼罗罗非鱼血液mRNA反转录获得编码罗非鱼Hsp70完整cDNA,重组构建罗非鱼真核表达载体pPIC9K/rtHsp70;在毕赤酵母Pichia pastoris KM71中表达重组罗非鱼的热休克蛋白70(rtHsp70),对表达上清液进行SDS-PAGE及Western blot分析;采用亲和层析、HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化目的蛋白。结果表明:克隆至pMD载体上的基因与目的基因完整编码区序列完全一致;诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western blot分析,上清液中蛋白条带大小与目的蛋白相对分子质量大小一致;每升诱导上清液可以获得约2 mg纯化蛋白。本研究中获得的rtHsp70毕赤酵母工程菌及纯化的rtHsp70为后期rtHsp70-肽疫苗研究奠定了基础。     

pPET-SUMF2各亚型的原核质粒构建及蛋白表达

构建人硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因各亚型的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pPET-SUMF2各亚型的融合蛋白。用EcoRI和XhoI双酶切人SUMF2各种亚型基因及质粒pPET-30a;将2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌DH5α。挑取菌落培养,提取质粒进行验证。将构建成功的pPET-SUMF2各亚型重组表达质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测SUMF2各亚型的融合蛋白表达。成功构建了pPET-SUMF2各亚型的重组表达质粒,并成功诱导SUMF2各亚型融合蛋白的表达,Western blot结果显示在预期位置有特异蛋白条带表达,并在BL21(DE3)内表达了SUMF2各亚型的融合蛋白,为进一步研究SUMF2的功能以及SUMF2与哮喘发病的关系奠定了基础。     

重组人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

目的:利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构(gAd)基因的高效原核表达体系,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化、鉴定及活性检测。方法:从正常人脂肪组织里面提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经诱导剂诱导后目的蛋白以包涵体形式产生,采用强碱促溶包涵体并用丙酮沉淀蛋白的方法进行复性和纯化,得到高纯度的人源性gAd。运用SDS-PAGE、Western blotting对重组蛋白进行鉴定,通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性。结果:成功构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的表达,并对形成的包涵体变性、复性和纯化,纯化出的蛋白经过SDS-PAGE和Western分析证实为gAd;通过对AMPK的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的gAd具有高生物学活性。结论:成功构建、表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构(gAd),为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础。     

梅毒螺旋体重组蛋白Tp0965的表达与鉴定

目的:研究梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0965(r Tp0965)的表达并鉴定其免疫反应性,为进一步探讨其在梅毒血清学诊断与疫苗中的应用价值奠定基础。方法:构建Tp0965原核表达重组体p ET-28a(+)/Tp0965,诱导转化宿主菌表达重组蛋白,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,Western blot鉴定其免疫反应性。结果:成功构建了原核表达重组体p ET-28a(+)/Tp0965,经诱导高效表达了一分子量约为43 KDa的可溶性重组蛋白,纯化蛋白纯度>95%;Western blot显示该纯化蛋白能被梅毒患者血清特异性识别。结论:高效表达了可溶性r Tp0965,该重组抗原有良好的免疫反应性。     

尼罗罗非鱼TIRAP基因克隆、组织表达及其在无乳链球菌、脂多糖和聚肌胞苷酸刺激下的免疫应答

为研究包含TIR结构域的接头蛋白(TIR domain-containing adaptor protein,TIRAP)基因在TLR信号介导的先天免疫中的调控作用,通过反转录-聚合酶链式反应和分段扩增获得了尼罗罗非鱼Oreochromis niloticusTIRAP基因的cDNA全长,并对其生物信息学进行分析,利用RT-qPCR法分析TIRAP在健康鱼各组织中的表达情况,以及在无乳链球菌Streptococcus agalactiae、脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后不同组织不同时间点的表达量变化。结果表明:TIRAP cDNA全长2 900 bp,开放阅读框为816 bp,可编码291个氨基酸;系统进化分析显示,尼罗罗非鱼与快乐东方鲷Astatotilapia calliptera TIRAP的亲缘关系较近;TIRAP在尼罗罗非鱼11个组织(肝、皮肤、心脏、肾、胃、鳃、脑、脾、肠、血液和肌肉)中均有表达,其中肌肉中表达量最高(P<0.05),胃中表达量相对较低;人工感染无乳链球菌引起TIRAP基因在肠和肾中上调表达,均在注射后1 d时表达量达到最大值;LPS和Poly I:C刺激引起TIRAP基因在肝、脾和肾中上调表达,但在肠中表达量均低于对照组(0 h)。研究表明,无乳链球菌、LPS和Poly I:C均能诱导TIRAP基因表达,TIRAP基因参与了尼罗罗非鱼免疫应答反应,暗示TIRAP在先天免疫中发挥作用。     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性分析

为进一步研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)ORF4蛋白的功能,通过PCR扩增CyHV-2 ORF4基因,并构建重组穿梭质粒pFastBac HTA-ORF4,将其转化至大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞后获得重组杆粒Bacmid-ORF4;采用脂质体法转染Sf9细胞后,利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot鉴定重组蛋白,采用His亲和层析柱纯化重组蛋白,并通过小鼠免疫试验分析其免疫原性。结果表明:转染72 h后Sf9细胞逐渐呈现出细胞变圆、细胞核明显增大的形态变化;间接免疫荧光结果显示,重组杆状病毒感染的Sf9细胞中出现了明显的绿色荧光;Western blot结果显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能够与抗His单抗发生特异性反应;小鼠免疫试验显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能诱导小鼠产生特异性免疫反应。研究表明,本研究中获得的CyHV-2 ORF4蛋白有较好的免疫原性,为CyHV-2 ORF4蛋白的功能解析提供了良好材料。     

异育银鲫肿瘤坏死因子α蛋白的原核表达、纯化及促凋亡活性分析

为了实现异育银鲫Carassius auratus gibelio肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)在大肠杆菌表达系统的高效表达,并研究其在促鲫鱼细胞凋亡中的作用,采用PCR的方法从体质量(15±1) g异育银鲫脾脏组织中扩增TNF-α基因,构建pET28a-TNF-α重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,通过Ni亲和层析柱纯化并采用尿素浓度梯度透析法进行蛋白复性,最后用rTNF-α蛋白处理鲫鱼鳍条细胞,通过Hoechst 33258染色法和荧光定量PCR技术,分析异育银鲫经rTNF-α蛋白处理后鲫鱼细胞的凋亡情况及凋亡相关基因Caspase 3和Caspase 8的表达变化。结果表明:诱导后获得了相对分子质量约为23 000的蛋白条带,且重组蛋白以包涵体形式存在;Western-blot显示,纯化产物与抗His单抗在相对分子量约23 000处出现了明显的反应条带,表明成功地实现了异育银鲫TNF-α的重组表达;进一步采用Hoechst 33258染色后发现,与正常细胞相比,经rTNF-α蛋白处理后的细胞核染色加深,呈碎块状浓染现象;荧光定量PCR显示,rTNF-α蛋白处理能使凋亡相关基因Caspase 3和Caspase 8 mRNA表达水平呈明显的上调趋势。研究表明,本文成功实现了异育银鲫TNF-α蛋白在大肠杆菌中的高效表达,且rTNF-α蛋白可诱导鲫鱼鳍条细胞发生凋亡,该工作将为后续研究TNF-α蛋白的抗病毒作用奠定基础。     

儿童青少年近视的防控研究进展

儿童青少年近视率一直处于高位并持续上升,严重影响了我国儿童青少年的学习和生活,本研究通过查阅国内外治疗儿童青少年近视相关著作及文献,针对目前儿童青少年近视防控手段的进展,对各治疗方案进行分析和研究。     

不同种类缓控释肥在鲜食型糯玉米上的应用效果

为研究缓控释肥在成都平原鲜食糯玉米种植中的效果。选用4种缓控释肥,以传统施肥(复合肥+尿素)为对照,采用随机区组试验设计,分析不同缓控释肥和当地传统施肥对鲜穗产量及产量性状的影响。结果表明:不同缓控释肥间及与传统施肥间对鲜穗产量的影响存在显著差异,T4 (N-P2O5-K2O:26-9-9)较传统施肥增产效果最好,鲜穗产量达到13517.04 kg/hm2,增产19.50%。与传统施肥相比,缓控释肥可以显著提高穗长、穗粗、穗行数、行粒数和百鲜粒重,显著降低秃尖长。本研究结果为缓控释肥技术在成都平原糯玉米种植中应用提供理论支撑。     

2004中国工程机械进出口分析

2004年,我国工程机械行业在宏观调控下加快结构调整,进口保持稳定,出口有重要进展,但没有重大突破.我国已成为世界工程机械重要市场和工程机械制造大国.     

武汉城市景观文化生态保护建设的问题与对策

城市文化生态是形成城市特色的文化要素。历史古迹,优秀建筑,空间形态,环境特色,作为城市文化生态的显现部分,既是城市文化底蕴直观生动的反映,也是市民的情感港湾和精神家园。理应得到珍惜和保护。该文在系统地概括武汉景观文化生态特点的基础上,重点分析了当前武汉城市景观规划建设中的文化生态问题,提出了武汉今后改进城市景观文化生态规划建设的对策建议。     

Driving forces and status of automation and robotics in construction in Europe

Automation and robotics in Europe are concentrated on concrete and asphalt mixing, concrete block and pipe making, precast concrete units and masonry prefabrication, control of mobile construction machinery, tunnelling, and renewing of buildings and sewers. The development has been going at a slow pace, because not all prerequisites to the introduction of these new technologies are fulfilled in the construction industry. Limited need for construction works on one hand, and shortage of skilled workers as well as new demands and tasks on the other hand stimulate the development—performed by manufacturers, construction companies, universities and institutes—in different ways. However, a survey around a lot of European specialists allows to draw a uniform picture of the driving forces and the current status of research, development, and usage of automation and robotics in construction (ARC).     

洪灾后村镇重建规划探讨--以黑龙江省杜伯特蒙古族自治县王府新村为例

本文结合洪灾后黑龙江省杜尔伯特蒙古族自治县王府新村规划,介绍重建家园所应遵循的指导思想,王府新村规划的总体思路和新村的用地布局特点以及民居特点.     

大长度大高度大吨位现浇段支架设计与施工

针对世界最大跨径连续刚构桥——重庆石板坡长江复线桥3、4号现浇段超长、超高、超重的特点,介绍了现浇段支架方案设计、计算和预拉及混凝土浇筑施工工艺及组织、控制措施。     

浅析GIS在小城镇防灾减灾规划中的应用

指出小城镇是区域发展的重要力量,其防灾减灾能力不可忽视,针对小城镇防灾减灾的特点和规划编制要求,对如何应用地理信息系统在用地评估、规划选址、空间布局等方面支持小城镇防灾减灾规划提出了见解。     

分时分温控制在高校供暖节能中的应用

针对高校能耗状况,分析了高校供热采暖系统的运行特点,发现采用分时分温自动控制技术可以充分挖掘高校供暖节能潜力。阐述了分时分温自动控制系统的节能原理,并在供热采暖系统中的得到实际应用。在寒假、平时、初寒期和末寒期4个不同时段,借助分时分温自动控制系统,取得了比较可观的节能效果。通过一个供暖季的运行,取得了较好的经济效益和环境效益,节约供热支出100余万元,当年收回了投资成本,同时,有效减少了CO_2、SO_2、氮氧化物等大气污染物的排放。     

高寒地区混凝土构筑物裂缝成因及预防

针对青藏高原季节性冻土区恶劣的自然环境条件特点,分析了青藏铁路部分桥涵裂缝的成因,提出了预防或减缓混凝土裂缝的具体措施。以引起后续工程施工的重视,确保其混凝土结构的长期耐久性能。