虹鳟IPNV分离株VP2蛋白的表达及免疫原性检测

为充分了解中国鱼类传染性胰腺坏死病病毒的系统进化,对流行病学调查分离出的虹鳟Oncorhynchus mykiss传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)分离株进行了系统进化分析,利用软件综合分析了IPNV病毒表面蛋白VP2的跨膜区、亲水性、抗原性和表面可能性,对其特定区段进行了原核表达,并利用表达蛋白制备鼠抗血清及免疫学鉴定。结果表明:本实验室得到的分离株与中国已报道的毒株具有不同的来源;SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP2蛋白为单一条带,相对分子质量约为45 000;ELISA分析显示,利用表达蛋白制备的鼠抗血清与IPNV分离株细胞培养物的效价为1∶20 000,与VP2蛋白的效价为1∶40 000;间接免疫荧光分析显示,细胞感染IPNV病毒24、48 h后,该鼠抗血清均能与IPNV毒株发生特异性反应,并呈现出特异性绿色荧光。研究表明,本研究中表达的VP2蛋白与IPNV病毒的VP2蛋白具有相近的免疫原性,这一结果为IPNV检测方法的建立及疫苗的构建提供了重要的试验依据。     

虹鳟IPNV分离株VP2蛋白的表达及免疫原性检测

为充分了解中国鱼类传染性胰腺坏死病病毒的系统进化,对流行病学调查分离出的虹鳟Oncorhynchus mykiss传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)分离株进行了系统进化分析,利用软件综合分析了IPNV病毒表面蛋白VP2的跨膜区、亲水性、抗原性和表面可能性,对其特定区段进行了原核表达,并利用表达蛋白制备鼠抗血清及免疫学鉴定。结果表明:本实验室得到的分离株与中国已报道的毒株具有不同的来源;SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP2蛋白为单一条带,相对分子质量约为45 000;ELISA分析显示,利用表达蛋白制备的鼠抗血清与IPNV分离株细胞培养物的效价为1∶20 000,与VP2蛋白的效价为1∶40 000;间接免疫荧光分析显示,细胞感染IPNV病毒24、48 h后,该鼠抗血清均能与IPNV毒株发生特异性反应,并呈现出特异性绿色荧光。研究表明,本研究中表达的VP2蛋白与IPNV病毒的VP2蛋白具有相近的免疫原性,这一结果为IPNV检测方法的建立及疫苗的构建提供了重要的试验依据。     

耻垢分枝杆菌MurB蛋白的可溶性表达、纯化和多克隆抗血清制备

获得耻垢分枝杆菌MurB纯化蛋白,制备小鼠源性MurB多克隆抗血清。首先,利用PCR技术扩增耻垢分枝杆菌murB基因,连接至pColdII载体并转化至E.coli BL21(DE3)菌株;然后,低温下以IPTG诱导MurB蛋白的表达,并利用Ni-His亲和层析技术纯化MurB蛋白;最后,将MurB纯化蛋白联合免疫佐剂注射BalB/c小鼠,经过初次免疫和2次加强免疫后分离抗血清,并分别利用ELISA和Western blot技术检测制备的抗血清对MurB蛋白的效价和特异性。结果显示:已获得具有理想浓度和纯度的MurB纯化蛋白;已制备具有较高效价的小鼠源性MurB多克隆抗血清,该抗血清能够特异性识别耻垢分枝杆菌可溶性蛋白组分中的MurB蛋白。因此,制备的MurB多克隆抗血清能够应用于分枝杆菌MurB蛋白的检测分析,为MurB功能研究奠定了基础。     

传染性胰脏坏死病毒VP2蛋白酵母表面展示系统的建立

为了将传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virous,IPNV)的主要保护性抗原及IPNV检测和疫苗开发的主要靶基因——VP2蛋白展示于酵母细胞表面,本研究中基于IPNV VP2基因序列设计引物,以IPNV ChRtm213的RNA为模板进行PCR扩增,然后将扩增产物连接到酵母表面展示载体pYD1上构建了重组质粒pYD1-VP2,将重组质粒转化至酵母EBY100感受态细胞中,得到含有重组质粒的酵母菌EBY100/pYD1-VP2,再向EBY100/pYD1-VP2中加入半乳糖进行VP2蛋白的诱导表达,并采用蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光技术对VP2蛋白的酵母表面展示情况进行了分析。结果表明:经半乳糖诱导后VP2蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达;细胞免疫荧光分析显示,重组酵母诱导表达后出现特异性绿色荧光,并且在一定时间内荧光强度与诱导时间成正相关,诱导24、36、48 h组及对照组(48 h)各组之间荧光酵母比例有显著性差异(P<0.05)。研究表明,IPNV VP2蛋白已经被酵母细胞高效表达并且成功展示于酵母细胞表面,本研究结果可为IPNV口服活载体疫苗的研制奠定基础。     

传染性胰脏坏死病酵母展示疫苗的免疫效果评价

为了评价前期构建的传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)VP2蛋白酵母展示疫苗(EBY100/pYD1-VP2)的免疫保护效果,以虹鳟Oncorhynchus mykiss为试验动物分析了口服免疫的保护效力,利用流式细胞仪和细胞免疫荧光检测方法确定疫苗株的最佳诱导时间为60 h,然后大量制备酵母口服疫苗,分别利用单次和多次口灌的方式对虹鳟进行免疫;单次免疫为连续免疫7 d,多次免疫为单次免疫一周后再以相同剂量免疫7 d,免疫剂量均为每天100μL疫苗菌(1×10⁽¹⁰⁾ CFU/mL),同时设置空载体酵母菌免疫组和PBS模拟免疫组,通过免疫相关基因定量、中和抗体滴定及攻毒后IPNV病毒载量分析口服疫苗的保护效果。结果表明:疫苗株免疫组虹鳟头肾、后肠中的免疫相关基因IgM、IgT、CD4、CD8在各时间点的表达量均显著高于空载体酵母菌免疫组和PBS模拟免疫组(P<0.05),且与单次免疫组相比,多次免疫组免疫相关基因表达量显著升高(P<0.05);在疫苗株免疫组虹鳟血清中均发现了中和抗体,其中,多次免疫组各时间点血清中和抗体效价均高于单次免疫组,免疫后第49天时IPNV中和抗体效价达到最高(39.28);病毒载量分析显示,各时间点疫苗株免疫组VP1和VP2基因表达量显著低于空载体酵母免疫组(P<0.05),并且在第14天、第21天时,疫苗株单次免疫组VP1和VP2基因表达量分别为疫苗株多次免疫组基因表达量的2.25、3.33倍(VP1)和2.67、2.80倍(VP2)。研究表明,该口服疫苗可诱导虹鳟产生非特异性和特异性免疫应答,对虹鳟具有显著的免疫保护作用。     

传染性胰脏坏死病毒VP2蛋白酵母表面展示系统的建立

为了将传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virous,IPNV)的主要保护性抗原及IPNV检测和疫苗开发的主要靶基因——VP2蛋白展示于酵母细胞表面,本研究中基于IPNV VP2基因序列设计引物,以IPNV ChRtm213的RNA为模板进行PCR扩增,然后将扩增产物连接到酵母表面展示载体pYD1上构建了重组质粒pYD1-VP2,将重组质粒转化至酵母EBY100感受态细胞中,得到含有重组质粒的酵母菌EBY100/pYD1-VP2,再向EBY100/pYD1-VP2中加入半乳糖进行VP2蛋白的诱导表达,并采用蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光技术对VP2蛋白的酵母表面展示情况进行了分析。结果表明:经半乳糖诱导后VP2蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达;细胞免疫荧光分析显示,重组酵母诱导表达后出现特异性绿色荧光,并且在一定时间内荧光强度与诱导时间成正相关,诱导24、36、48 h组及对照组(48 h)各组之间荧光酵母比例有显著性差异(P<0.05)。研究表明,IPNV VP2蛋白已经被酵母细胞高效表达并且成功展示于酵母细胞表面,本研究结果可为IPNV口服活载体疫苗的研制奠定基础。     

草鱼呼肠孤病毒VP5蛋白的表达与纯化

从草鱼Ctenopharyngodon idellus出血病病原——草鱼呼肠孤病毒GCRV-873株扩增病毒的外壳蛋白(GCRV-VP5)基因,并将GCRV-VP5基因克隆到原核表达载体pET-30α,转化至大肠杆菌E.coli BL-21(DE3)中后,用IPTG诱导培养,获得带有重组质粒菌体的总蛋白。用GCRV-873毒株免疫山羊得到的抗血清作为一抗进行免疫印迹试验,结果在硝酸纤维素膜上检测到在相对分子质量为77 000处有特异性免疫条带,与预测的GCRV-873 VP5蛋白一致,提示大肠杆菌融合表达草鱼出血病病毒的VP5蛋白。表达的融合蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,经柱层析纯化后蛋白纯度可达90%。本试验中获得的融合蛋白可为后期免疫动物提供了抗原,也为建立GCRV免疫学检测方法提供了依据。     

传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

通过人工合成方法得到传染性造血器官坏死病毒(IHNV)糖蛋白(G蛋白)基因,将该基因克隆到表达载体pET-30a,构建重组表达质粒pET-30a/IHNV-G,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plySs中。经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析表明,在1 mmol/L IPTG(诱导剂)、37℃条件下诱导4 h后,G蛋白在大肠杆菌中成功表达,得到了相对分子质量约为57 000的G蛋白。采用直接切胶免疫小鼠的方法制备多克隆抗体,ELISA分析结果显示,血清效价可达到1∶10 000。本试验中得到的G蛋白和多抗血清可为IHNV疫苗的研制以及胶体金试纸条快速检测方法的建立提供理论基础。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达纯化鲤春病毒血症病毒(SVCV)G蛋白,制备特异性单克隆抗体,扩增出鲤春病毒0504分离株G基因片段,并将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,经诱导表达、裂解离心包涵体,包涵体经His Bind亲和层析柱纯化及尿素浓度梯度复性后,作为抗原免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体。结果表明:成功筛选出2株稳定分泌G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1C5、2D5,经Western-Blot检测表明,制备的单克隆抗体具有良好的特异性。本研究中成功制备的抗G蛋白单克隆抗体,可为建立新型鲤春病毒检测方法提供工具。     

虹鳟传染性胰脏坏死病毒的分离鉴定及聚类分析

为研究传染性胰脏坏死病毒(IPNV)感染虹鳟Oncorhynchus mykiss的病理特性,取云南省某养殖场大规模死亡的虹鳟稚鱼进行了病原的分离与鉴定,试验中利用鲑鳟鱼常见病毒敏感细胞大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(Chinook salmon embryo cells,CHSE-214)、鲤上皮瘤细胞(Epitheliaoma papulosum cyprinid,EPC)和虹鳟性腺细胞(Rainbow trout gonad cell line,RTG-2)对虹鳟稚鱼无菌组织悬液进行病毒培养,并对产生细胞病变的上清进行病毒RNA提取及鲑鳟鱼常见病毒的RT-PCR检测,利用敏感细胞进行病毒分离株的噬斑培养及滴度测定,并对病毒形态进行透射电镜观察。结果表明:细胞培养显示,该组织悬液能使CHSE-214和RTG-2细胞产生明显的细胞病变;RT-PCR结果显示,检测样本呈IPNV阳性,传染性造血器官坏死病毒(IHNV)呈阴性;该IPNV分离株(命名为Ch Rtm213)在CHSE-214、RTG-2和EPC细胞上的病毒滴度分别为10^(5.2)、10(5.2)、10^(3.2)、10(3.2)、10^(2.3) TCID_(50)/m L,在CHSE-214细胞上培养4 d即可形成肉眼可见的病毒噬斑;在透射电镜下清晰可见大量病毒粒子呈晶格状排列于细胞质内;Ch Rtm213分离株与西班牙毒株2310(AY489225)VP2相似度较高,核苷酸序列一致性为96.4%;聚类分析结果显示,Ch Rtm213分离株与参考毒株加拿大Jasper(ATCC:VR-1325)聚为一簇,属于Gengroup 5基因型。研究表明,Ch Rtm213分离株异于已报道的IPNV分离株,具有不同的血清型及病毒毒力,可为传染性胰脏坏死病毒的检测及防控提供参考。     

住宅楼安装中央空调的加固案例分析

文章通过两处住宅用房安装中央空调的事例,现场查勘、验算与鉴定,证实了在住宅用房的混凝土梁上钻孔洞安装中央空调管线的做法,影响了房屋结构的安全,同时给出了加固处理意见,提出了个人的几点看法.     

测量标志普查资料汇集技术处理

为了适应新的形势发展需要,安徽省国土资源厅已启动新一轮测量标志普查工作。与过去不同,此次普查在资料汇集、调查人员组织、调查资料归档与调用等方面做了较大变革,文章简明阐述了变革后的测量标志普查资料汇集技术处理的过程。     

Regularities of development of settling of models of deep footings

Conclusions 1. The effect of relative penetration on the change in magnitude of settlement is substantial. With the same specific pressure on the base the settlement of the model decreases as the relative penetration increases.2. Published data on values of unit friction forces along lateral surfaces of deep foundations were confirmed. The maximum value of resistance along the side surface was 2 tons/m².3. It was established that the realtionship between the settlement of the model and its diameter is nonlinear. This is of great importance in working out a method for calculating foundations of deep footings from deformations especially if one considers that in this case the foundation carries substantial pressures and deforms under conditions of strongly developed shear regions.Translated from Osnovaniya, Fundamenty i Mekhanika Gruntov, No. 6, pp. 11–12, November–December, 1971.     

自动扶梯逆行故障成因与分析

对自动扶梯突然反转而导致逆行故障的类别和成因进行了分析,讨论了逆行速度及症状,分析了逆行概率及风险,并针对逆行提出了一些对策。     

浅析步行街的建筑工效学——上海市吴江路步行街建筑工效学调研

从建筑工效学的角度对上海市吴江路休闲步行街进行了调查研究，根据调查结果，分析了其在建筑工效学上的一些特点与不足之处并进行了探讨，以期对步行街的建筑工效学设计提供准确的参考。     

环境的共鸣--大连水产学院图书馆的设计

本文通过对大连水产学院图书馆的介绍,向人们展示了建筑与环境之间相辅相成,共同作用,引起环境共鸣的原则方法.     

浅谈饲料中有效能的测定技术

饲料中有效能是供动物生长发育的基础。不同动物所用的有效能体系不同,目前大多数动物采用消化能、代谢能体系,但随着研究的发展与深入,发现最能反映饲料有效能的是净能体系。无论哪种体系,采用合理的测定技术准确测定饲料中的有效能值显得尤其重要,通过对饲料有效能值的准确测定可以实现动物所需能量的精确供给,减少养殖成本,使经济效益最大化。文章综述了几种有效能评价体系的测定技术。     

混凝土碳化深度的灰色预测

混凝土碳化是导致钢筋混凝土结构耐久性损伤的主要原因之一。为了预测混凝土碳化深度,本文建议采用一种基于灰色系统理论的预测模型,该模型可以根据已知的混凝土碳化序列,较精确地预测未来时刻的碳化深度。文章最后以实例说明了该模型的应用。