两种石斑鱼性腺分化前后脑垂体中FSHβ和LHβ细胞免疫组织化学及其基因表达

为了解石斑鱼Epinephelus性腺分化前后脑垂体中促卵泡激素(FSHβ)和黄体生产素(LHβ)细胞分布及基因含量的变化,以赤点石斑鱼Epinephelus akaara和黑边石斑鱼E.fasciatus为研究对象,采用苏木精-伊红染色法(H.E.)对孵化后55、80、120日龄幼鱼的性腺和脑垂体结构进行组织学观察,同时运用免疫组织化学技术(IHC)对两种石斑鱼脑垂体中FSHβ和LHβ进行识别和定位,并运用qRT-PCR技术测定其脑垂体中fshβ和lhβ基因含量的变化。结果表明:赤点石斑鱼和黑边石斑鱼早期性腺发育分为未分化期、分化期和卵巢期;石斑鱼性腺在55日龄时为未分化阶段,其位于肠道附近且观察到性细胞和血管,80日龄时为性腺分化阶段,性腺原基两端的结缔组织向前延伸并形成突起,表明卵巢腔正在形成,120日龄时为卵巢阶段,卵巢腔已完全形成且观察到卵原细胞,表明石斑鱼性腺已分化为雌性;两种石斑鱼在55、80、120日龄时的脑垂体结构相似,分为神经垂体(NH)和腺垂体(AH),腺垂体进一步细分为前外侧部(RPD)、中外侧部(PPD)和中间部(PI);在55、80、120日龄时,两种石斑鱼脑垂体中均检测到FSHβ和LHβ免疫信号,其主要分布在PPD区域,少量分布在RPD或PI区域;赤点石斑鱼脑垂体中fshβ基因含量在120日龄时显著高于55、80日龄(P<0.05),但lhβ基因含量无显著性差异(P>0.05),黑边石斑鱼脑垂体中fshβ和lhβ基因含量在120日龄时均显著高于55、80日龄(P<0.05)。研究表明,两种石斑鱼性腺在120日龄时已分化完成,脑垂体结构在55日龄时已完全形成且脑垂体中FSHβ和LHβ在两种石斑鱼性腺分化过程中起重要作用,其角色可能是促进个体的早期发育和加速性细胞的增殖。     

红鳍东方鲀抗苗勒氏管激素(AMH)基因在不同发育时期的组织表达

为研究抗苗勒氏管激素(AMH)基因在红鳍东方鲀Takifugu rubripes各组织和不同发育时期的表达情况以及在性别分化和性腺发育等过程中的作用,利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)技术对红鳍东方鲀成鱼的肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢和卵巢等组织进行了amh基因的表达分析以及不同发育时期(23、30、40、60、80日龄及2龄和3龄鱼)红鳍东方鲀个体水平上amh基因的表达分析。结果表明:红鳍东方鲀3龄成鱼脾脏、肾脏和肝脏中的amh基因表达量极显著高于其他组织(P<0.01),在精巢和心脏中的表达量极显著高于卵巢和脑(P<0.01),其中脾脏中表达量最高,脑中表达量最低;红鳍东方鲀23日龄、30日龄、2龄和3龄鱼中,雄鱼amh基因的表达量极显著高于同期雌鱼(P<0.01),而60日龄和80日龄时雌鱼表达量显著高于雄鱼(P<0.05),40日龄时雌、雄鱼的表达量无显著性差异(P>0.05),3龄时雌、雄个体性腺中amh基因的表达量均显著高于2龄鱼(P<0.05);雄性幼鱼amh基因的表达量从23~30日龄呈增长趋势,且在30日龄时达到最高,随后逐渐降低,而雌鱼整体amh基因的表达量也呈现先升高后降低的趋势,80日龄时雌鱼amh基因表达量最高。研究表明,amh基因在红鳍东方鲀的性腺发育和性别分化过程中发挥着一定的作用。     

红鳍东方鲀抗苗勒氏管激素(AMH)基因在不同发育时期的组织表达

为研究抗苗勒氏管激素(AMH)基因在红鳍东方鲀Takifugu rubripes各组织和不同发育时期的表达情况以及在性别分化和性腺发育等过程中的作用,利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)技术对红鳍东方鲀成鱼的肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢和卵巢等组织进行了amh基因的表达分析以及不同发育时期(23、30、40、60、80日龄及2龄和3龄鱼)红鳍东方鲀个体水平上amh基因的表达分析。结果表明:红鳍东方鲀3龄成鱼脾脏、肾脏和肝脏中的amh基因表达量极显著高于其他组织(P<0.01),在精巢和心脏中的表达量极显著高于卵巢和脑(P<0.01),其中脾脏中表达量最高,脑中表达量最低;红鳍东方鲀23日龄、30日龄、2龄和3龄鱼中,雄鱼amh基因的表达量极显著高于同期雌鱼(P<0.01),而60日龄和80日龄时雌鱼表达量显著高于雄鱼(P<0.05),40日龄时雌、雄鱼的表达量无显著性差异(P>0.05),3龄时雌、雄个体性腺中amh基因的表达量均显著高于2龄鱼(P<0.05);雄性幼鱼amh基因的表达量从23³0日龄呈增长趋势,且在30日龄时达到最高,随后逐渐降低,而雌鱼整体amh基因的表达量也呈现先升高后降低的趋势,80日龄时雌鱼amh基因表达量最高。研究表明,amh基因在红鳍东方鲀的性腺发育和性别分化过程中发挥着一定的作用。     

低温诱导红鳍东方鲀雄性化及性腺分化的组织学观察

为探索无需紫外线照射、无需投喂性激素、操作简单的低温诱导红鳍东方鲀Takifugu rubripes雄性化的新方法,分别在孵化后15、45、75d将鱼苗进行15℃和17℃低温处理65d,以正常培育温度21℃为对照组,设置平行试验组,并对其性比及性别分化的组织学进行了观察。结果表明:(1)在15℃条件下,试验组雄性率最高可达(74.70±2.79)%;在17℃条件下,试验组雄性率最高为(59.60±3.49)%;在21℃条件下,对照组雄性率为(51.57±0.06)%;温度与雄性率呈负相关(R=-0.827),与雌性率呈正相关(R=0.823)。(2)在21℃条件下,对照组孵化后48d时出现卵巢腔,标志着卵巢分化的开始,68d时生殖腺柄部出现裂缝状的输精管原基,标志着精巢开始分化;在17℃条件下,试验组孵化后63d时观察到明显的卵巢腔,83d时出现输精管原基性腺;而在15℃条件下,试验组孵化后73d时出现明显卵巢腔,93d时出现精小叶,标志组织学上的分化。研究表明,随着处理温度的升高,性腺中细胞分裂速度呈线性关系,在一定范围内升温有助于性腺的发育。     

养殖斑鳠的性腺发育及其组织学观察

采用常规石蜡切片技术,对人工养殖斑鳠Mystus guttatus的性腺发育进行了初步研究。结果表明:人工养殖斑鳠2龄左右时达到性成熟,繁殖期为6—8月;卵巢发育为不同步型,同一期卵巢内存在多个时相的卵母细胞,繁殖期的卵巢性腺成熟系数(GSI)为(1.28±0.12)%;精巢外形细长,内部发育良好,精子发育过程中的各阶段细胞形态清晰可见,繁殖期的精巢GSI为(0.11±0.04)%。研究表明,斑鳠个体性腺发育不同步,属于一次产卵类型。     

卵胎生许氏平鲉Sox9基因的克隆、启动子分析、表达及其细胞定位研究

为研究卵胎生许氏平鲉Sebastes schlegeli性腺分化及性别决定分子机制,采用同源克隆和RACE技术从许氏平鲉(体质量758 g±15 g)性腺组织中获得了许氏平鲉Sox9基因全长cDNA,运用生物学软件对Sox9启动子转录因子结合位点进行预测,并利用实时定量PCR和原位杂交对Sox9基因的表达进行了研究。结果表明:许氏平鲉Sox9基因cDNA全长2039 bp,包括1461 bp的ORF,336 bp的5′UTR和242 bp的3′UTR,其编码产物(486 aa)含有高度保守的HMG结构域;许氏平鲉Sox9基因启动子区存在多个转录因子结合位点,包括AP-1、GATA-3、Oct-1、FOXD3,以及性别相关SRY、Sox5、Sox9等蛋白结合位点;实时定量PCR显示,许氏平鲉Sox9基因在仔鱼发育阶段(出生后1～35日龄)均有表达,在性腺分化的敏感时期(25日龄)表达量达到较高水平;在成体性腺中显示了性别两相性差异,即在精巢中的表达高于卵巢;原位杂交显示,许氏平鲉Sox9基因在精巢的生殖细胞、Sertoli细胞,以及卵巢的卵母细胞和滤泡细胞中均有表达。研究表明,Sox9基因在许氏平鲉性腺分化及性腺发育过程中可能发挥重要作用。     

大鳞鲃生长、血清性激素水平和性腺发育的研究

为掌握大鳞鲃Luciobarbus capito F1代生长、血清性激素变化、性腺发育规律和后备亲鱼的初次性成熟时间,采用形态学、组织学和生物化学方法,对养殖条件下1⁵龄大鳞鲃的生长特点、血清性激素含量和性腺发育进行了研究。结果表明:随着年龄的增长,大鳞鲃体质量和体长显著增加(P<0.05),体长与体质量的关系式为W=0.012L2.99(R2=0.99),Von Bertalanffy生长方程为Lt=107.43[1-e-0.15(t+0.067)]、Wt=12939[1-e-0.15(t+0.067)]2.99;15龄大鳞鲃的生长特点、血清性激素含量和性腺发育进行了研究。结果表明:随着年龄的增长,大鳞鲃体质量和体长显著增加(P<0.05),体长与体质量的关系式为W=0.012L2.99(R2=0.99),Von Bertalanffy生长方程为Lt=107.43[1-e-0.15(t+0.067)]、Wt=12939[1-e-0.15(t+0.067)]2.99;1⁵龄雄鱼血清中雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)含量均低于雌鱼,15龄雄鱼血清中雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)含量均低于雌鱼,1⁴龄雌鱼血清中17β-E2含量随年龄的增加而升高,在4龄时达到最高值,为(713.00±424.89)pg/m L;5龄雄鱼血清中的睾丸酮(Testosterone,T)含量最高,为(1.12±0.81)ng/m L,其余各龄组血清中T含量无显著性差异(P>0.05);大鳞鲃精巢为典型的小叶型结构,精小叶间有间质细胞,小叶内有支持细胞及精小囊结构,精子发育可分为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、成熟精子5个时相,5龄雄鱼成熟系数(GSI)达到最大值(0.83%);大鳞鲃卵巢中卵母细胞发育可分5个时相,GSI为0.51%4龄雌鱼血清中17β-E2含量随年龄的增加而升高,在4龄时达到最高值,为(713.00±424.89)pg/m L;5龄雄鱼血清中的睾丸酮(Testosterone,T)含量最高,为(1.12±0.81)ng/m L,其余各龄组血清中T含量无显著性差异(P>0.05);大鳞鲃精巢为典型的小叶型结构,精小叶间有间质细胞,小叶内有支持细胞及精小囊结构,精子发育可分为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、成熟精子5个时相,5龄雄鱼成熟系数(GSI)达到最大值(0.83%);大鳞鲃卵巢中卵母细胞发育可分5个时相,GSI为0.51%⁸.90%,5龄雌鱼成熟系数最大(8.90%)。研究表明,大鳞鲃雌鱼性腺4龄时部分成熟,5龄时完全成熟,雄鱼性腺比雌鱼早成熟一年,在人工繁殖过程中,大鳞鲃后备亲鱼在雄鱼4龄、雌鱼5龄时适合人工药物催产。     

大鳞鲃生长、血清性激素水平和性腺发育的研究

为掌握大鳞鲃Luciobarbus capito F1代生长、血清性激素变化、性腺发育规律和后备亲鱼的初次性成熟时间,采用形态学、组织学和生物化学方法,对养殖条件下1~5龄大鳞鲃的生长特点、血清性激素含量和性腺发育进行了研究。结果表明:随着年龄的增长,大鳞鲃体质量和体长显著增加(P<0.05),体长与体质量的关系式为W=0.012L2.99(R2=0.99),Von Bertalanffy生长方程为Lt=107.43[1-e-0.15(t+0.067)]、Wt=12939[1-e-0.15(t+0.067)]2.99;1~5龄雄鱼血清中雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)含量均低于雌鱼,1~4龄雌鱼血清中17β-E2含量随年龄的增加而升高,在4龄时达到最高值,为(713.00±424.89)pg/m L;5龄雄鱼血清中的睾丸酮(Testosterone,T)含量最高,为(1.12±0.81)ng/m L,其余各龄组血清中T含量无显著性差异(P>0.05);大鳞鲃精巢为典型的小叶型结构,精小叶间有间质细胞,小叶内有支持细胞及精小囊结构,精子发育可分为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、成熟精子5个时相,5龄雄鱼成熟系数(GSI)达到最大值(0.83%);大鳞鲃卵巢中卵母细胞发育可分5个时相,GSI为0.51%~8.90%,5龄雌鱼成熟系数最大(8.90%)。研究表明,大鳞鲃雌鱼性腺4龄时部分成熟,5龄时完全成熟,雄鱼性腺比雌鱼早成熟一年,在人工繁殖过程中,大鳞鲃后备亲鱼在雄鱼4龄、雌鱼5龄时适合人工药物催产。     

红鳍东方鲀卵巢与精巢的蛋白质组比较分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes性腺发生的相关机制,选择3龄体质量约2.0 kg的红鳍东方鲀成熟卵巢与精巢组织,利用非标记定量技术(Lable-free)对卵巢与精巢两种组织蛋白质组进行定性与定量分析,并运用GO、KEGG分析等方法对差异表达的蛋白进行富集分析。结果表明:非标记定量显示,在两组织间卵巢中特有的蛋白为150个,精巢中特有的蛋白为132个,有172个在卵巢中表达较高的蛋白及161个在精巢中表达较高的蛋白,在卵巢中存在与卵巢发育相关的高表达蛋白ELAVL2、RNA helicase、LSM4和FRUYP1,而在精巢中特异表达蛋白GSDF影响精巢发育;经GO分析发现,RNA结合(RNA binding)可能影响卵巢发育,两组织差异蛋白在膜组成部分(Integral component of membrane)具有最大差值;GO功能显著性富集分析得出,转移酶活性(Transferase activity)在两组织之间差异最显著;KEGG通路分析显示,核糖体通路(Ribosome)在两组织间差异蛋白最多,该通路也可能与性腺发育相关,通路中核糖体蛋白L10A被证实与一些物种性别发育相关,并发现吞噬体(Phagosome)、溶酶体(Lysosome)及鞘脂代谢通路(Sphingolipid signaling pathway)可能与精子成熟相关。研究表明,红鳍东方鲀卵巢与精巢蛋白质组差异较大,与卵巢发育相关的蛋白有ELAVL2和RNA helicase及核糖体通路等,与精巢发育相关的蛋白有GSDF及吞噬体通路等,本研究结果可为红鳍东方鲀性腺组织发育研究提供参考。