fps转基因烤烟类胡萝卜素及其降解产物的研究

为探索法呢基焦磷酸合酶(fps)对烤烟中类胡萝卜素及其降解产物的影响,利用常规和GS/MS方法,对转fps基因烟草株系(K-4、K-6、K-17、K-35)烤后烟叶中类胡萝卜素含量及萜烯类香气物质含量进行了分析,结果发现,烤后烟叶类胡萝卜素含量有较大差异,与未转基因对照相比普遍有所提高,其中K-35含量最高;8种类胡萝卜素降解产物及茄酮、新植二烯含量有不同程度的提高,其中K-35香气降解产物含量整体较高,表明外源fps基因在烟草中的表达对类胡萝卜素合成具有促进作用,从而有利于烟叶品质的提高。     

成熟期温度对烟叶质体色素积累及香气成分的影响

为明确成熟期温度对烟叶品质风格的影响机制,以烟草品种K326为材料,采用盆栽试验在烟株打顶后将其分别转移至日均温度28.1℃和22.8℃的人工气候室中控温培养,在培养30 d后对中部叶片细胞结构、色素积累及烟叶香气成分进行分析。叶片超微结构观察结果显示,在烟叶成熟期高温条件下,叶片细胞核降解程度提高,淀粉粒含量(质量分数)丰富,嗜锇颗粒数量多、体积较大,叶绿体降解充分,类囊体片层不完整。LC/MS分析表明,成熟期高温处理的叶片中质体色素,包括β-胡萝卜素、新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b等含量(质量分数)均低于低温处理的叶片。而在烤后烟叶中类胡萝卜素降解产物芳樟醇、异佛尔酮、β-二氢大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮4、法尼基丙酮、螺岩兰草酮等,叶绿素降解产物新植二烯含量显著高于低温处理的叶片。因此,烟叶成熟期高温促进了叶片细胞结构的降解和内含物质的积累,有利于质体色素降解和香气物质的生成,对烟叶品质和风格具有较大影响。     

烟叶衰老过程中类胡萝卜素代谢及相关基因表达分析

成熟叶片中类胡萝卜素含量与烟叶品质密切相关。为探究烟草叶片衰老过程中类胡萝卜素组分变化及代谢相关基因表达情况,本研究以普通烟草红花大金元为材料,采用液相色谱法测定不同发育时期烟叶中新黄质、叶黄质和β-胡萝卜素的含量;通过转录组数据分析结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法,分析烟草叶片衰老成熟过程中类胡萝卜素代谢相关基因的表达变化。结果显示,烟草进入成熟衰老期叶片中新黄质、叶黄质、β-胡萝卜素含量逐渐降低;类胡萝卜素合成基因GGPS、PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LYCB和LYCE呈现下调表达,类胡萝卜素降解基因LOX、POD和CCD1呈现上调表达,PAL和PPO呈现下调表达。类胡萝卜素转化基因ZEP、NXS、NCED呈上调表达。类胡萝卜素合成相关转录因子基因ORANGE、HY5、COP1、DET1呈现下调表达,而MYB5b、Cry-2呈现上调表达。随着烟叶成熟衰老,类胡萝卜素合成减弱,而降解增强。研究结果为烟叶成熟衰老过程中类胡萝卜素代谢的分子调控及针对类胡萝卜素含量定向改良烟草品种奠定了基础。     

烤烟中性致香物质在烘烤前后的差异分析

为探求烘烤过程对烤烟中性致香物质的影响,采用顶空固相微萃取-全二维飞行时间质谱联用法和半叶法研究了K326和南江3号烟叶中性致香物质种类、含量及其比例在烘烤前后的差异。结果表明:(1)多种香气物质在烘烤过程中发生了转化,有19种香气物质在烤后烟叶未检测到,但增加了36种香气物质。(2)烘烤后香气物质总量显著增加,且不同品种烤烟香气物质转化程度不同,K326的香气物质总量(不含新植二烯)显著高于南江3号。(3)烘烤后西柏烷类降解产物占中性致香物质总量的比例明显降低,而苯丙氨酸降解产物和类胡萝卜素降解产物所占比例明显提高。在烘烤过程中损失了醛、醇和酯类等19种香气物质,产生了类胡萝卜素降解产物、棕色化反应产物等36种香气物质。     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的转录表达模式及功能分析

为了明确烟草β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase,β-OHase)基因的转录表达模式和功能,进而调控烟草类胡萝卜素的代谢,通过Real-time PCR分析了普通烟草(Nicotiana tabacum)品种红花大金元盛花期的β-OHase基因在不同器官中的表达量。利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中β-OHase基因的表达,在该基因成功沉默后,通过Real-time PCR检测其下游基因表达量,同时检测烟草中β-胡萝卜素、紫黄质和新黄质含量(质量分数)。结果显示,β-OHase基因在叶片中的表达量明显高于其他器官(P0.05)。与对照相比,在该基因沉默后,下游的紫黄质脱环氧化酶基因(VDE)和玉米黄质环氧化酶基因(ZE)的表达量明显降低,同时β-胡萝卜素含量显著升高,而紫黄质和新黄质含量则显著降低(P0.05)。     

烟草NtGGPPS4基因的克隆和功能初步分析

为明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因Nt GGPPS4的功能,从普通烟草中克隆到该基因,构建了超量表达载体p CAMBIA1300-Nt GGPPS4,并通过农杆菌介导法转化烟草。进一步测定了转基因烟株中西柏烷二萜醇和质体色素的含量。结果表明:共鉴定出4株Nt GGPPS4表达量明显升高的转基因植株,且转基因植株中α-西柏三烯二醇(α-cembrenediol,α-CBD)和β-西柏三烯二醇(β-cembrenediol,β-CBD),以及新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素等6种质体色素含量都有显著提高。表明Nt GGPPS4参与了烟草西柏烷二萜醇和类胡萝卜素的生物合成。     

饼肥对烤烟叶片不同发育时期类胡萝卜素及其主要降解产物的影响

采用盆栽试验研究了饼肥对不同发育时期烤烟叶片类胡萝卜素及其主要降解产物的影响。结果表明,烟叶发育过程中类胡萝卜素各组分含量随生育时期逐渐下降,不同处理间烟叶类胡萝卜素含量变化存在差异。50%饼肥处理可促进烟叶类胡萝卜素总量、新黄质、叶黄素和中后期β-胡萝卜素的积累,而用量过高不利于初期和末期烟叶中紫黄质的积累;适宜的饼肥用量可调节发育末期类胡萝卜素类物质的组分构成,在烟叶发育期,50%饼肥处理的烟叶中多数类胡萝卜素降解产物总量较大,β-大马酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等物质含量也较其它两个处理高。      

烤烟碳氮代谢关键酶活性动态及其与类胡萝卜素关系研究

以红花大金元、K326为试验材料,采用大田种植方式,研究了不同基因型烤烟叶片碳氮代谢关键酶的活性动态及其与类胡萝卜素的相关性。结果表明,在烟草生长发育过程中,硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖转化酶和淀粉酶活性均呈现先上升后降低的变化规律,硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和淀粉酶在移栽后60 d达到最大值,而蔗糖转化酶活性最大值出现在移栽后75 d。类胡萝卜素各组分（β-类胡萝卜素、叶黄素、新黄质和紫黄质）含量随着生育进程的推移,呈下降趋势。在整个生育期内,红花大金元叶片硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖转化酶和淀粉酶活性以及类胡萝卜素各组分含量均高于K326。相关分析结果表明,蔗糖转化酶活性与类胡萝卜素各组分含量呈显著负相关。     

fps基因过量表达对烟叶类胡萝卜素生物合成的影响

为探索法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因过量表达对烤烟叶片类胡萝卜素生物合成的影响,利用RT-PCR技术,比较了4个fps转基因株系(K4、K-6、K-17、K-35)及其非转基因对照中参与类胡萝卜素生物合成的关键酶基因的表达强度,并利用LC/MS技术,分析了叶片发育过程中类胡萝卜素及其各组分含量的变化规律.结果表明:外源fps在烟草中的过量表达,对烟叶类胡萝卜素合成相关基因Psy、Lycb皆有正向调节作用,但对Zds的表达影响不大;化学分析表明fps转基因烤烟株系中,总类胡萝卜素及其各组分的含量在叶片不同发育期均高于未转基因K326对照株系.说明外源fps基因在烟草中的过表达,对类胡萝卜素生物合成具有促进作用.     

不同氮素形态配比对烤后烟叶主要挥发性香气物质含量的影响

氮素形态配比试验表明:不同部位间,烤后烟叶新植二烯、芳香族氨基酸代谢产物、美拉德反应产物、西柏烷类降解产物及挥发性香气物质总量的变异均达到极显著水平.处理间,除类胡萝卜素降解产物外,其他烤后烟叶香气物质的变异均达到极显著水平.不同氮素形态配比相比较,随着硝态氮施用比例的提高,烤后烟叶不同部位各类香气物质含量和挥发性香气物质总量呈上升趋势,其中以70%硝态氮 30%铵态氮处理的效果最为明显.在定氮(75 kg/hm~2)条件下,不同硝态氮比例与挥发性香气物质间均存在不同程度的正相关关系.对下部叶,硝态氮比例与美拉德反应产物的相关系数达到了极显著水平;对中部叶,硝态氮比例与新植二烯及挥发性香气物质总量的相关系数均达到极显著水平,与美拉德反应产物及西柏烷类降解产物的相关系数也均达到显著水平;对上部叶硝态氮比例与美拉德反应产物及西柏烷类降解产物的相关系数均达到极显著水平,与芳香族氨基酸代谢产物的相关系数也达到显著水平.总之.在氮用量相同的条件下,适当地增加硝态氮比例有助于挥发性香气物质含量的提高.     

高烟碱K326定向改良材料的创制与分析

为了明确NtJAZ1基因对烟碱含量（质量分数）和烟株生长发育及品质的影响,以烤烟品种K326为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtJAZ1基因进行敲除,获得了纯合突变株系NK-9。测序结果表明,NtJAZ1-1在1 587~1 641 bp之间大片段缺失,NtJAZ1-2在1 547~1 548 bp之间缺失了2个碱基,导致翻译提前终止。RT-PCR检测结果表明,NK-9烟碱生物合成关键基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的表达水平显著提高。田间调查发现,NK-9株系生长发育正常,株高、叶数和叶宽显著高于对照K326,但叶长显著低于K326。显微观察表明,NK-9叶面腺毛密度较对照有所降低。对现蕾期、打顶期和成熟期烟碱含量检测发现,NK-9株系中部叶的烟碱含量分别比对照提高33.26%、36.41%和39.28%。烤后烟叶化学成分分析表明,NK-9常规化学成分比例协调,烟碱含量较对照提高44.91%;中性香气成分中新植二烯、类胡萝卜素类降解产物含量明显增加,但棕色化反应产物、苯丙氨酸类降解产物和茄酮含量有所降低。说明敲除NtJAZ1基因能够有效提高烟叶烟碱含量,对腺毛发育和叶面化学成分的积累也有一定影响。      

多腺毛烟草K326品种基因编辑材料的创制与分析

烟草腺毛与烟株抗性和烟叶品质密切相关。为了定向改良烟草腺毛密度、创制多腺毛烟草材料,以烟草品种K326为材料,利用CRISPR-Cas9技术对腺毛发生负向调控基因NtCycB2进行敲除,创制了多腺毛K326定向改良材料HK326(Hairy K326),并分析了NtCycB2基因敲除对烤烟农艺性状和化学成分的影响。结果表明:NtCycB2基因敲除后烟株发育正常,生长旺盛,农艺性状与对照相比无明显变化;烟草叶面腺毛密度显著提高,分泌型腺毛发育完善,物质合成和分泌旺盛,西柏烷二萜化合物含量显著提高;烤后烟叶中性香气成分总量增加,其中,茄酮及新植二烯类成分增幅最为明显。因此,NtCycB2基因的敲除,不仅能够提高烟草的腺毛密度,而且对烟株生长发育和重要香气物质的积累也有促进作用,在烟草品种改良中具有较大的应用潜力。     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为有效调控烟草类胡萝卜素的合成代谢,从普通烟草中克隆到与植物类胡萝卜素合成代谢相关的β-胡萝卜素羟化酶基因BCH,以辣椒BCH基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码BCH基因的cDNA序列,暂命名为NtBCH1(GenBank登录号JQ410446)。NtBCH1包含一个完整的开放阅读框,编码309个氨基酸,具备脂肪酸羟化酶超家族保守结构域。序列比对结果表明,NtBCH1蛋白与其他植物的BCH蛋白具有很高的相似性。系统进化树分析表明,NtBCH1与番茄的亲缘关系最近。     

四川和河南烤烟叶片番茄红素β环化酶基因的表达分析

为了探明四川和河南烤烟烟叶类胡萝卜素差异的分子机理,揭示同一品种烤烟在四川和河南产生不同香气风格的机理,采用半定量RT-PCR和Northern杂交方法检测了四川和河南烤烟现蕾期叶片中类胡萝卜素合成关键基因番茄红素β环化酶基因(Lyc-β)的表达水平,并用高效液相色谱法测定了同期烟叶中类胡萝卜素的含量。结果显示,四川烤烟现蕾期叶片中Lyc-β基因的表达水平显著高于河南的;四川烟叶的叶黄素和β胡萝卜素含量显著高于河南的。     

烟草类胡萝卜素降解关键基因CCD1的克隆与表达分析

烟草类胡萝卜素是烟叶重要致香物质的前体物,利用RACE方法获得了烟草品种K326类胡萝卜素降解关键基因CCD1的2个cDNA全长序列。序列分析表明,CCD1-1与CCD1-2各包含一个1635和1647bp的开放读码框(ORF),编码544和548个氨基酸。分别与林烟草和绒毛状烟草CCD1存在一个碱基的差异。CCD1-1与CCD1-2基因序列GC含量为43.24%和42.87％。预测的蛋白质分子量均为61 kDa, 理论等电点 (pI) 6.51和6.55。与番茄和辣椒等植物的类胡萝卜素CCD1的同源性达到80％以上。跨膜区预测表明分别在138～158和142~162位氨基酸间有1个跨膜螺旋区。蛋白质二级结构分析表明,均以β折叠和无规则卷曲为主。蛋白三维结构预测分析表明CCD1-1与CCD1-2空间结构极为相似。组织表达分析表明,CCD1-1与CCD1-2在花中的表达最强,根中的表达最弱,茎和叶次之。这些结果为进一步研究类胡萝卜素降解基因的功能提供了依据。      

中烟207及其亲本0953高香气性状的物质基础研究

为探讨中烟207高香气性状形成的物质基础，比较分析了中烟207及其亲本云烟85、0953的烤后烟叶致香物质种类和含量，并比较了与云烟85姊妹系品种云烟87的差异。结果表明，中烟207类胡萝卜素降解物β-大马酮、β-二氢大马酮、金合欢基丙酮、3-羟基-β-二氢大马酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、芳樟醇，美拉德反应产物5-甲基糠醛、2-正戊基呋喃、3-乙酰基吡啶、麦芽酚、吡喃酮，西柏烷降解物茄酮，以及苯丙氨酸降解物苯甲醇、苯乙醛、苯乙醇等15种成分含量高于云烟87，可能是其香气质好，香气量高的原因。0953中类胡萝卜素降解物、叶绿素降解物、美拉德反应产物、苯丙氨酸降解物总含量高于云烟85和云烟87，可能是其高香气特性的重要物质基础。云烟85和云烟87致香物质具有高度相似的特点。类胡萝卜素降解物、叶绿素降解物、苯丙氨酸降解物等香气物质含量相对较高可能是0953和中烟207高香气性状的共同物质基础。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的克隆和功能分析

为进一步明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的功能,根据已公布的普通烟草(Nicotiana tabacum)GGPPS1基因编码区序列设计特异性引物,从普通烟草K326中克隆到NtGGPPS1基因。构建荧光表达载体PFF19-Nt GGPPS1-GFP,对NtGGPPS1基因进行亚细胞定位研究。通过荧光定量PCR分析了普通烟草K326在不同激素处理下NtGGPPS1基因的表达量变化。构建NtGGPPS1基因的RNAi载体pHellsgate2-Nt GGPPS1,通过农杆菌浸染烟草K326后获得NtGGPPS1基因显著下调的烟株,检测了烟株中质体色素含量的变化情况。结果表明:Nt GGPPS1融合蛋白基因的绿色荧光分布在烟草BY-2细胞的质体上,表明该基因定位于质体。用茉莉酸甲酯(MeJA)处理烟草后,NtGGPPS1基因的表达量显著升高,而用生长素(IAA)处理后,该基因的表达量下降。与对照相比,在NtGGPPS1基因下调的烟株中其质体色素含量均显著降低,预示NtGGPPS1参与了烟草β-胡萝卜素的生物合成。     

NtMYB68基因对烟草苗期紫黄质和脱落酸生物合成及烟株耐旱性的影响研究

  目的  为探究烟草NtMYB68基因在类胡萝卜素和脱落酸合成生物合成中的作用及其对烟株抗旱性的影响。  方法  从烤烟品种K326中同源克隆NtMYB68基因,采用生物信息学分析NtMYB68基因序列特征,利用RT-PCR分析其在烟草不同组织的表达模式。利用基因编辑手段创制NtMYB68敲除材料,并分析NtMYB68基因敲除后对烟株类胡萝卜素合成及抗旱性的影响。  结果  NtMYB68基因有2个拷贝,NtMYB68-1和NtMYB68-2。NtMYB68在烟草根、茎、叶、花中均有表达,NtMYB68-2的表达水平显著高于NtMYB68-1。NtMYB68敲除材料与对照相比,紫黄质合成基因NtZEP显著上调,紫黄质含量显著增加,脱落酸（ABA）合成基因NtNCED5表达量达到对照植株的4倍。干旱胁迫下,敲除材料幼苗与对照相比,叶片萎蔫程度更轻,长势更优,复水处理后生长状态恢复的更好。干旱处理前后,敲除植株中ABA的含量均显著提高。  结论  NtMYB68转录因子能抑制NtZEP和NtNCED5基因表达,敲除该基因可以提高烟叶中紫黄质的积累,促进脱落酸的合成,从而提高烟株抗旱性。      

水合有机溶液体系中类胡萝卜素聚集体的探究

类胡萝卜素具有多种对人体有益的生理活性,在一定条件下分子可自聚集形成不同类型的聚集体。本文主要以水合有机溶液的比例和加样顺序为关键因素,探究其对三种代表性类胡萝卜素（虾青素、叶黄素、β-胡萝卜素）聚集体的类型（H聚集体、M单体、J聚集体）、形成条件和稳定性的影响。分别将虾青素丙酮溶液、叶黄素乙醇溶液、β-胡萝卜素丙酮溶液以水入有机和有机入水两种不同滴加顺序,按照有机溶剂占总体积比以10%～90%的比例混合,观察类胡萝卜素小分子及其聚集体的状态并进行紫外可见吸收光谱分析。结果表明,在有机入水的加样顺序下,虾青素、叶黄素、β-胡萝卜素溶液体系下形成H聚集体的有机溶剂占总体积比分别为10%～20%、10%～50%和10%～40%,此外,虾青素在30%形成J聚集体,β-胡萝卜素在50%～70%形成J聚集体,叶黄素在60%～90%时为叶黄素单体。在水入有机的加样顺序下,形成聚集体的条件与有机入水相似。但是通过对比发现,在有机入水的加样顺序下,紫外可见光谱上吸收峰移动的现象更明显。探究聚集体稳定性发现,样品在室温（25℃）条件下放置24 h和48 h后,叶黄素的H聚集体类型不变,虾青素、β-胡萝卜...     

氮素对烤烟基因型间香味基础物质及相关性状的影响

为研究氮素对不同烤烟基因型香味基础物质及相关性状的影响。以高香气烤烟新品系8306、高香气杂交种Y892和常规烤烟品种K326、中烟100 为材料,对不同氮肥水平下不同香气特征基因型烤烟的质体色素含量、叶面分泌物含量等香味基础物质相关性状的变化特征和差异进行了分析。结果表明,中氮水平下,各基因型类胡萝卜素含量最高;8306 和Y892类胡萝卜素的积累速度要高于K326 和中烟100;中氮处理的叶面分泌物含量在各个叶龄期均高于低氮处理和高氮处理;8306和Y892 在中部烟叶叶面分泌物含量最高期高于K326 和中烟100;不同基因型烤烟氮素的代谢积累有较大差别;不同基因型烤后烟叶中性香气基础物质总量,随氮用量增加8306 的含量升高,K326 的含量降低。以提高烟叶香气基础物质含量为目标的栽培管理中要根据品种特点进行氮肥运筹。