苯并(a)芘诱导对双齿围沙蚕腺苷酸环化酶(AC)基因及酶活性表达的影响

为探讨双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis对外源污染物的毒性响应,分析了不同苯并(a)芘[B(a)P]浓度(0.5、5、10、15μg/L)胁迫下双齿围沙蚕(体质量为1.5～2.5 g)腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)的基因表达和酶活性变化特征,利用RACE方法获得了沙蚕AC基因cDNA全长,并利用实时荧光定量PCR技术分析了苯并(a)芘诱导下沙蚕AC基因的变化。结果表明:双齿围沙蚕AC基因cDNA全长为4900 bp,包括5′非翻译区127 bp,3′非翻译区1536 bp,开放阅读框3237 bp,编码1078个氨基酸;该序列包含两个保守环化酶催化结构域,与其他动物氨基酸序列一致性为34%～47%;不同浓度的苯并(a)芘诱导会引起沙蚕AC基因表达量上升,0.5、10μg/L苯并(a)芘浓度组AC表达量在诱导第7天时达到最大,而5、50μg/L苯并(a)芘浓度组在诱导第14天时达到最大;利用ELISA试剂盒分析苯并(a)芘诱导下双齿围沙蚕AC酶活性变化,结果显示,在第4天时0.5、5、50μg/L浓度组AC酶活性上升到最高,之后随时间的延长酶活性降低,而10μg/L浓度组AC酶活性略低于空白对照组且在第7天时达到最高值。研究表明,苯并(a)芘会在一定程度上诱导沙蚕AC的基因表达及酶活性变化。     

Cd(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)胁迫对双齿围沙蚕热休克蛋白70(HSP70)基因表达的影响

为研究重金属浓度的变化对双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis热休克蛋白70(heat shock proteins 70,HSP70)基因的表达变化,采用实时荧光定量PCR方法,分析了重金属Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)单一诱导及联合作用下双齿围沙蚕HSP70基因的表达规律。结果表明:Cu(Ⅱ)单独作用时,沙蚕HSP70 mRNA表达量随时间的增加而增大,在诱导的第3天时不同浓度组沙蚕HSP70 mRNA表达量依次为22.86μg/L浓度组>44.50μg/L浓度组>4.45μg/L浓度组,而在诱导的第7天和第14天时HSP70 mRNA表达量与Cu(Ⅱ)浓度呈正相关;Cd(Ⅱ)单独作用时,沙蚕HSP70 mRNA表达量则随Cd(Ⅱ)浓度和诱导时间的增加而增大,但较Cu(Ⅱ)单独作用下变化趋势平缓;Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)联合作用下,沙蚕HSP70 mRNA表达量亦与暴露浓度和时间呈正相关,在诱导的第3天和第7天时45.70μg/L Cu(Ⅱ)+10μg/L Cd(Ⅱ)浓度组HSP70 mRNA表达量高于Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)单一作用,表明Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)存在一定的协同作用。     

Cd(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)胁迫对双齿围沙蚕热休克蛋白70(HSP70)基因表达的影响

为研究重金属浓度的变化对双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis热休克蛋白70(heat shock proteins 70,HSP70)基因的表达变化,采用实时荧光定量PCR方法,分析了重金属Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)单一诱导及联合作用下双齿围沙蚕HSP70基因的表达规律。结果表明:Cu(Ⅱ)单独作用时,沙蚕HSP70 mRNA表达量随时间的增加而增大,在诱导的第3天时不同浓度组沙蚕HSP70 mRNA表达量依次为22.86μg/L浓度组>44.50μg/L浓度组>4.45μg/L浓度组,而在诱导的第7天和第14天时HSP70 mRNA表达量与Cu(Ⅱ)浓度呈正相关;Cd(Ⅱ)单独作用时,沙蚕HSP70 mRNA表达量则随Cd(Ⅱ)浓度和诱导时间的增加而增大,但较Cu(Ⅱ)单独作用下变化趋势平缓;Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)联合作用下,沙蚕HSP70 mRNA表达量亦与暴露浓度和时间呈正相关,在诱导的第3天和第7天时45.70μg/L Cu(Ⅱ)+10μg/L Cd(Ⅱ)浓度组HSP70 mRNA表达量高于Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)单一作用,表明Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)存在一定的协同作用。     

镉对中间球海胆性腺脂质过氧化的影响

研究了不同浓度的镉离子对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius性腺超氧化物歧化酶(S0D)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性以及丙二醛(MDA)含量的影响。结果显示:低浓度的镉能激活海胆性腺SOD、CAT和GPx的活性,但随着镉离子浓度的增加和时间的延长,3种酶活性都受到不同程度的抑制;各试验组MDA的含量显著高于对照组。说明镉能引起海胆性腺脂质过氧化损伤。     

Cd(Ⅱ)对泥鳅抗氧化酶活性和脂质过氧化的影响

研究了不同浓度的Cd(Ⅱ)对泥鳅肝脏内抗氧化酶包括超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性的影响以及对脂质过氧化指标——丙二醛(MDA)含量的影响,探讨了在Cd(Ⅱ)胁迫下,泥鳅肝组织内抗氧化酶活性以及脂质过氧化的变化趋势及其关系。结果表明:低浓度Cd(Ⅱ)(0.025 mg/L)对泥鳅肝脏中SOD活性有诱导作用,并随着处理时间的延长而升高,对CAT和POD活性以及MDA含量无显著影响;当Cd(Ⅱ)浓度较高时(0.25、2.5 mg/L),SOD、CAT、POD 3种抗氧化酶活性呈现先诱导后抑制的趋势,Cd(Ⅱ)浓度越高,抗氧化酶活性上升越急剧,出现活性抑制的时间就越提前。SOD活性对Cd(Ⅱ)浓度及时间变化较敏感,CAT和POD次之,MDA含量变化与抗氧化酶活性变化呈相反趋势。     

Zn~(2+)胁迫对花斑裸鲤抗氧化关键基因表达和抗氧化酶活性的影响

为探讨水体Zn⁽²⁺⁾对鱼类的影响,并筛选出有效的生物标记物,以花斑裸鲤Gymnocypris eckloni幼鱼(体质量为10 g±3 g)为试验对象,分别以1、2、5、10、20 mg/L Zn(2+)对鱼类的影响,并筛选出有效的生物标记物,以花斑裸鲤Gymnocypris eckloni幼鱼(体质量为10 g±3 g)为试验对象,分别以1、2、5、10、20 mg/L Zn⁽²⁺⁾为胁迫浓度,计算24、48、72、96 h时的半致死浓度(LD_(50)),经1 mg/L Zn(2+)为胁迫浓度,计算24、48、72、96 h时的半致死浓度(LD_(50)),经1 mg/L Zn⁽²⁺⁾胁迫12、24、48、72、96 h后,采用qPCR技术检测鳃、肾脏和肝脏组织中抗氧化防御系统相关的核因子E2相关因子2(Nrf2)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)基因表达量变化,以热图分析各基因在3种组织中的应答层次,以及用吸光度法测定SOD、CAT和GPx抗氧化酶活性的变化。结果表明:Zn(2+)胁迫12、24、48、72、96 h后,采用qPCR技术检测鳃、肾脏和肝脏组织中抗氧化防御系统相关的核因子E2相关因子2(Nrf2)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)基因表达量变化,以热图分析各基因在3种组织中的应答层次,以及用吸光度法测定SOD、CAT和GPx抗氧化酶活性的变化。结果表明:Zn⁽²⁺⁾对花斑裸鲤幼鱼胁迫24、48、72、96 h时的半致死浓度(LD_(50))分别为5.0、3.2、2.5、2.0 mg/L,安全浓度为0.2 mg/L;在Zn(2+)对花斑裸鲤幼鱼胁迫24、48、72、96 h时的半致死浓度(LD_(50))分别为5.0、3.2、2.5、2.0 mg/L,安全浓度为0.2 mg/L;在Zn⁽²⁺⁾胁迫96 h内,花斑裸鲤Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx基因表达量及SOD、CAT和GPx酶活性均有不同程度的升高,但升高幅度各异;基因表达量热图分析显示,与鳃、肾脏和肝脏组织中Nrf2的4个下游基因表达量相比,Nrf2表达量相对较低,尤其在肾脏和肝脏组织中表现更为明显。研究表明,花斑裸鲤Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx基因表达量及相关酶活性与Zn(2+)胁迫96 h内,花斑裸鲤Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx基因表达量及SOD、CAT和GPx酶活性均有不同程度的升高,但升高幅度各异;基因表达量热图分析显示,与鳃、肾脏和肝脏组织中Nrf2的4个下游基因表达量相比,Nrf2表达量相对较低,尤其在肾脏和肝脏组织中表现更为明显。研究表明,花斑裸鲤Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx基因表达量及相关酶活性与Zn⁽²⁺⁾胁迫存在一定的时间相关性和组织特异性,其可作为预警水体Zn(2+)胁迫存在一定的时间相关性和组织特异性,其可作为预警水体Zn⁽²⁺⁾污染的备选生物标记物。     

双齿围沙蚕CYP4基因的克隆及序列分析

根据已知的绿沙蚕Nereis virens细胞色素氧化酶CYP342A1保守区设计引物,采用RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis体壁肌肉中克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因全长序列。分析结果表明,该序列全长为1 857 bp,5'端非翻译区为186 bp,3'端非翻译区为225 bp,阅读框为1 446 bp,编码为481个氨基酸。第422～431氨基酸序列符合P450所具有的结构保守共有序列FxxGxxxCxG,第319～322氨基酸序列为K螺旋特征基序ExxR区,第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTT。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行同源性比对,CYP4与多毛类绿沙蚕Nereis virens CYP4BB1、CYP342A1(AY453408)氨基酸同源性为73%、36%,与多毛类小头虫Capitella capitata CYP4AT1(AY574044)同源性为39%。据此推断,双齿围沙蚕CYP4基因属于CYP4B亚家族。     

双齿围沙蚕对牙鲆配合饲料的表观消化率及其与温度和体重的关系

在16、20、24℃3个温度条件下,以三氧化二铬(Cr2O3)作为标记物,测定了双齿围沙蚕Perine-reis aibuhitensis对牙鲆配合饲料的表观消化率(AD)。沙蚕按湿重分为3组:S组(0.50 g±0.19 g)、M组(1.00 g±0.22 g)和L组(2.00 g±0.50 g)。结果表明:1)摄食混合Cr2O3饲料的沙蚕与摄食正常饲料的沙蚕体内Cr的残留量差异不显著(P=0.686,F=0.189)。2)在试验条件下,双齿围沙蚕对饲料中干物质、蛋白质、有机碳和能量的AD分别为76.7%⁹0.6%、86.4%90.6%、86.4%⁹6.6%、88.0%96.6%、88.0%⁹5.7%和84.0%95.7%和84.0%⁹2.1%;温度对4种AD的影响均极显著(F=8.829、P=0.002,F=25.330、P<0.001,F=9.360、P=0.001,F=18.131、P<0.001);而体重对4种AD的影响均不显著。3)试验温度下,各组双齿围沙蚕的肠道排空时间(GPT)为(61±14.15)92.1%;温度对4种AD的影响均极显著(F=8.829、P=0.002,F=25.330、P<0.001,F=9.360、P=0.001,F=18.131、P<0.001);而体重对4种AD的影响均不显著。3)试验温度下,各组双齿围沙蚕的肠道排空时间(GPT)为(61±14.15)^(131±13.00)min,体重对GPT的影响极显著(F=10.195,P=0.001),而温度对GPT影响不显著。     

双齿围沙蚕对饲料中氮元素的利用及其与体质量和温度的关系

对不同体质量双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis在不同温度条件下对牙鲆配合饲料中氮元素的利用和氮收支进行了研究。试验按沙蚕体湿重设置(0.40±0.19)、(1.00±0.22)、(2.00±0.50)g 3个组,分别记为S、M和L组,每组分别设16、20、24℃3个温度梯度。结果表明:1)20℃时各组双齿围沙蚕对氮的摄食率均达到最大值,平均为17.0 mg/(d.g),变幅为14.3～22.0 mg/(d.g);2)双齿围沙蚕于不同温度下对氮的摄食率均随体质量的增加而降低,其中,S组为10.5～22.0 mg/(d.g),M组和L组则分别为8.0～14.7、6.6～14.3 mg/(d.g),氮摄食率与体质量的关系可用幂函数式CN=aWb表示,其中a值在20℃时最高,为10.618,b值为-0.2076～-0.1911;3)双因素方差分析表明,温度和体质量对沙蚕的氮摄食率均有极显著影响(F=79.125,P<0.001;F=34.308,P<0.001);4)在本试验条件下,双齿围沙蚕对饲料中氮的累积率平均为11.8 mg/(d.g),以摄食氮为100%计,累积氮所占的比例最大,平均为88.99%,排粪氮次之,为9.43%,而排泄氮所占的比例最低,仅为1.58%。     

雌激素对双齿围沙蚕性比、生长和卵母细胞发育的影响

将性未分化的双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis暴露在双酚A和17β-雌二醇两种雌激素下,研究了雌激素对双齿围沙蚕雌雄比例、个体生长、死亡率及卵母细胞发育的影响。结果表明,两种雌激素各浓度下的试验组沙蚕均为雌性。与对照组相比,双酚A浓度为50、100μg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用(P<0.01);浓度为10、150μg/L时,对沙蚕的促生长作用显著(P<0.05);浓度为200μg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显;沙蚕的死亡率随双酚A浓度的提高而增加。与对照组相比,当17-β雌二醇浓度为1、5、15 mg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用(P<0.01);浓度为30 mg/L时,对沙蚕的促生长作用显著(P<0.05);浓度为45 mg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显;随着浓度的提高,沙蚕的死亡率明显加大。双酚A浓度为10¹50μg/L、17β-雌二醇浓度为1150μg/L、17β-雌二醇浓度为1³0 mg/L时,对沙蚕卵母细胞的生长有明显的促进作用(P<0.01);而双酚A浓度为200μg/L(P<0.05)和17β-雌二醇浓度为45 mg/L(P<0.01)时对卵母细胞的生长有抑制作用。