拟穴青蟹抗菌肽SCY2在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

为深入研究拟穴青蟹Scylla paramamosain阴离子抗菌肽SCY2的抗菌活性,将抗菌肽SCY2的成熟肽序列与毕赤酵母Pichia pastoris的p PIC9K质粒连接,构建了分泌型表达载体p PIC9K-SCY2,用电击法将其转化至毕赤酵母GS115菌株中,经甲醇诱导表达和亲和纯化后获得目的蛋白,并进行质谱鉴定和抗菌活性分析。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-SCY2,用0.5%甲醇诱导表达24 h后,分泌表达上清液中获得了相对分子质量约11 000的稳定表达产物,与预期的抗菌肽SCY2成熟肽的大小相符;纯化后的目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;抗菌活性结果表明,抗菌肽SCY2能抑制革兰氏阳性菌生长,对被测的革兰氏阴性菌无抑杀活性(>50μmol/L);抗菌肽SCY2同抗生素进行协同抗菌试验,发现SCY2与四环素协同使用对荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的抑杀存在协同作用,SCY2与青霉素协同使用对施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的抑杀具有增强作用。研究表明,较低浓度的抗生素与抗菌肽协同使用可有效地减少抗生素的使用,降低食品中抗生素的残留风险。     

拟穴青蟹抗菌肽SCY2在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

为深入研究拟穴青蟹Scylla paramamosain阴离子抗菌肽SCY2的抗菌活性,将抗菌肽SCY2的成熟肽序列与毕赤酵母Pichia pastoris的p PIC9K质粒连接,构建了分泌型表达载体p PIC9K-SCY2,用电击法将其转化至毕赤酵母GS115菌株中,经甲醇诱导表达和亲和纯化后获得目的蛋白,并进行质谱鉴定和抗菌活性分析。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-SCY2,用0.5%甲醇诱导表达24 h后,分泌表达上清液中获得了相对分子质量约11 000的稳定表达产物,与预期的抗菌肽SCY2成熟肽的大小相符;纯化后的目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;抗菌活性结果表明,抗菌肽SCY2能抑制革兰氏阳性菌生长,对被测的革兰氏阴性菌无抑杀活性(>50μmol/L);抗菌肽SCY2同抗生素进行协同抗菌试验,发现SCY2与四环素协同使用对荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的抑杀存在协同作用,SCY2与青霉素协同使用对施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的抑杀具有增强作用。研究表明,较低浓度的抗生素与抗菌肽协同使用可有效地减少抗生素的使用,降低食品中抗生素的残留风险。     

人源类溶菌酶蛋白6在毕赤酵母中的重组表达及活性分析

利用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人源类溶菌酶蛋白6(human lysozyme-like protein6,h Lyzl6),对其酶学性质进行分析。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成h Lyzl6基因,将其连接至含有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的p PIC9K质粒构建重组表达载体p PIC9K-hlyzl6;重组表达载体经线性化后电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选获得高拷贝重组菌株后进行甲醇诱导表达。经甲醇诱导72 h后发酵液上清中酶活性达到最高值,发酵液上清经SDSPAGE检测在14.8 k Da处有重组h Lyzl6蛋白条带,分子量符合预期,通过甲壳素亲和层析可对其进行纯化;采用比浊法测定h Lyzl6酶学活性,结果表明h Lyzl6对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)有较好的杀灭作用,最适反应温度为40℃,最适p H为5.5,其酶活力为54 700U/mg,Cu2+对其活性有明显抑制,EC50为30.2799 mg/L。采用基因工程方法首次在毕赤酵母GS115成功表达了重组h Lyzl6,证实其在体外具有杀菌活性,初步揭示h Lyzl6在男性生殖系统先天性免疫中发挥了一定作用,为进一步研究h Lyzl6的功能和应用开发奠定了基础。     

杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性测定

为获得溶血活性低、抗菌活性高的杂合抗菌肽,以家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin为母体肽,并结合毕赤酵母偏爱密码子的原则,设计出6条具有抗菌潜力的新型杂合抗菌肽,将其命名为CC22、CC28、CC29、CC30和CC34(1),CC34,利用SOE-PCR技术合成所需的目的基因,并将其克隆至毕赤酵母表达载体p GAPZαA,通过电击转化技术,将其转化至毕赤酵母SMD1168中,经含有Zeocin的抗性平板筛选阳性转化子,YPD液体培养72h后,经Tricine-SDSPAGE检测出目的蛋白,然后采用高效液相色谱法对其进行纯化。检测结果显示,表达产物CC29对大肠杆菌、鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)均为25μg/ml;CC34(1)对大肠杆菌表现相对较弱的抑制作用,最小抑菌浓度为100μg/ml;CC34对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为50μg/ml;且杂合抗菌肽对有益菌均没有表现出抑制作用。6条杂合肽的溶血活性均呈现较低水平,其中表现出抗菌活性的3条抗菌肽中,以CC29的溶血活性最低,CC34(1)和CC34相对次之。结合抑菌活性,CC29和CC34的抑菌效果较为明显,从而确定溶血活性低且抗菌活性较高的CC29和CC34为新型杂合抗菌肽。     

皱纹盘鲍HdhTPX2基因在毕赤酵母中的表达及抗氧化活性研究

为研究皱纹盘鲍Haliotis discus hannai Ino硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX2)蛋白的抗氧化活性,将HdhTPX2基因克隆至pPIC9K载体,通过电击转化至毕赤酵母GS115菌株中,获得重组表达质粒pPIC9K-HdhTPX2,经甲醇诱导及亲和层析纯化得到重组HdhTPX2蛋白,并进行质谱鉴定及体外抗氧化功能检测。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-HdhTPX2,经表达条件的优化,在pH为7的培养基中用0.5%甲醇诱导表达72 h,分泌表达上清液中得到相对分子质量约为25 000的稳定表达产物,纯化后的蛋白经质谱鉴定为目的蛋白;体外活性测定发现,该蛋白清除羟自由基(·OH)能力强于维生素C,并对H_2O_2引起的细胞损伤具有一定的保护作用。研究表明,皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化物酶HdhTPX2在毕赤酵母表达系统中得到高效表达,重组表达产物具有抗氧化活性功能。     

毕赤酵母STE13基因敲除对GGH表达及其生物活性的影响

目的:重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-GGH表达的人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白[(GLP-1 A2G)2-HSA,GGH]的细胞活性测评结果显示生物活性较低,这可能与其表达过程中蛋白降解有一定关联。通过对毕赤酵母GS115 STE13基因的敲除,获得一株完整表达蛋白GGH的毕赤酵母宿主,并进一步提高其表达产物GGH的生物活性。方法:采用基于PCR技术介导的Cre-Loxp系统重组技术成功敲除宿主菌GS115的STE13基因,得到一株STE13缺陷型菌株GS115/D13,并通过细胞活性测评系统检测GS115/D13表达产物GGH的生物活性。结果:通过对STE13基因缺陷型菌株GS115/D13与出发菌株GS115/W发酵表达对比,显示GS115/D13菌株表达融合蛋白GGH生物活性有明显提升,且表达量提高了25.8%,两菌株生长无明显差异。结论:STE13基因的敲除成功缓解了GGH表达过程中的降解问题,并相对出发菌株GS115/W大幅度提高了蛋白生物活性。     

皱纹盘鲍HdhTPX2基因在毕赤酵母中的表达及抗氧化活性研究

为研究皱纹盘鲍Haliotis discus hannai Ino硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX2)蛋白的抗氧化活性,将HdhTPX2基因克隆至pPIC9K载体,通过电击转化至毕赤酵母GS115菌株中,获得重组表达质粒pPIC9K-HdhTPX2,经甲醇诱导及亲和层析纯化得到重组HdhTPX2蛋白,并进行质谱鉴定及体外抗氧化功能检测。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-HdhTPX2,经表达条件的优化,在pH为7的培养基中用0.5%甲醇诱导表达72 h,分泌表达上清液中得到相对分子质量约为25 000的稳定表达产物,纯化后的蛋白经质谱鉴定为目的蛋白;体外活性测定发现,该蛋白清除羟自由基(·OH)能力强于维生素C,并对H_2O_2引起的细胞损伤具有一定的保护作用。研究表明,皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化物酶HdhTPX2在毕赤酵母表达系统中得到高效表达,重组表达产物具有抗氧化活性功能。     

一种具杀菌功能的haFGF融合基因在毕氏酵母中的表达

目的构建一种双功能活性多肽,实现其在酵母中的表达。方法通过体外DNA重组技术将cecropin AD连接在haFGF的5′端,构建成融合基因CADAF,将其克隆到分泌表达载体pPICZαA上,然后转化到毕氏酵母受体菌X-33中进行甲醇诱导表达。结果经SDS PAGE和Western blot分析,构建的CADAF基因在酵母中获得了表达,经抑菌实验及MTT实验结果表明,融合蛋白具有一定的抗菌功能和促细胞分裂活性。结论成功实现了haFGF与抗菌肽的在酵母中的融合表达,为多功能细胞生长因子在创伤治疗中的应用打下了基础。     

基于重组毕赤酵母的fusaruside生物合成

目的:构建产fusaruside的毕赤酵母菌株,解决天然小分子免疫抑制剂fusaruside的来源问题。方法:从禾谷镰刀菌Fusarium graminearum PH-1中扩增获得合成fusaruside的相关基因-3位去饱和酶[Δ3(E)-SD]和10位去饱和酶[Δ10(E)-SD]基因;并通过2A肽策略构建两种基因的共表达载体,转化到毕赤酵母GS115中进行双酶的诱导表达;对诱导后的毕赤酵母菌体进行甲醇和二氯甲烷的处理后,经高效液相色谱质谱联用仪(HPLC-MS)检测其中产物变化。结果:3位去饱和酶和10位去饱和酶在毕赤酵母中成功共表达,SDS-PAGE显示3位去饱和酶分子量约为48kDa,10位去饱和酶分子量约为65kDa; HPLC-MS显示重组酵母可以产生fusaruside。结论:与fusaruside原产菌株镰刀菌相比,该酵母菌的发酵时间更短、产量更高,为fusaruside的进一步开发与应用奠定基础。     

重组毕赤酵母(Pichia pastoris)高产Lunasin的发酵工艺优化

Lunasin是一个最初从大豆中分离,具有43个氨基酸的多肽,具有抗高血压,抗氧化活性,预防癌症,抗炎和降胆固醇的活性。为了实现Lunasin的高效生产,对重组毕赤酵母GS115 LN诱导阶段甲醇补料策略(溶氧反馈补料,指数-恒速补料)以及诱导温度进行了优化,并且在此基础上对双碳源(山梨醇、甘露醇)和甲醇混合补料策略以及复合氮源与甲醇混合补料策略进行了优化。研究表明,最优补料策略以及诱导温度分别为指数-恒速补料、24℃,最终在流加1%大豆蛋白胨以及0.02%天冬氨酸条件下,Lunasin表达量最高,达到3.27 g/L,是单一甲醇诱导的1.27倍。     

Modeling antimicrobial contaminant removal in slow sand filtration

Slow sand filters are used in rural regions where source water may be subjected to antimicrobial contaminant loads from waste discharges and diffuse pollution. A numerical model (LETA) was derived to calculate aqueous antimicrobial concentrations through time and depth of a slow sand filter and estimate accumulating contaminant mass in the schmutzdecke. Input parameters include water quality variables easily quantified by water system personnel and published adsorption, partitioning, and degradation coefficients. Simulation results for the tetracycline, quinolone, and macrolide classes of antimicrobials suggested greater than 3-log removal from 1 microg/L influent concentrations within the top 40 cm of the sand column, with schmutzdecke antimicrobial concentrations comparable to other land-applied waste biosolids. A 60-day challenge experiment injecting 1 microg/L tylosin to a pilot slow sand filter showed an average 0.1mg/kg of the antimicrobial remaining in the schmutzdecke layer normally removed during filter maintenance, and this value was the same order of magnitude as the sorbed concentration predicted by the LETA model.     

一类生态环境建材——抗菌防霉建材

人类的生存环境、居住空间受到环境污染和有害微生物的威胁,清洁、卫生、舒适的居住空间已成为人们的追求。因而抗菌建材作为一类生态环境功能建材,受到人们的青睐。本人介绍了可用于抗菌建材的各类无机抗菌材料及利用这些抗菌材料制作的一些不同类别的抗菌建材。     

Environmental antimicrobial contamination from terraccumulation and diffuse pollution pathways

The fate of antimicrobial pharmaceuticals entering the aquatic environment has become an increasing concern for researchers and regulators in the past decade, and recent research has focused on antimicrobial contamination from point sources, such as wastewater treatment facility outfalls. Terraccumulation is the concentration of pollutants in soils from land application of contaminated biosolids generated by agricultural practices and water and wastewater facilities. The terraccumulation of antimicrobials and mobility in diffuse pollution pathways should not be overlooked as a contributor to the spread of bacterial resistance and the resulting threat to human drug therapy. This review critically examines recent global trends of bacterial resistance, antimicrobial contaminant pathways from agriculture and water treatment processes, and the need to incorporate diffuse pathways into risk assessment and treatment system design. Alignment of environmental scientific and engineering research with strategies applied in clinical situations could contribute to continued efficacy of antimicrobial therapies necessary for human health and welfare.     

The cytotoxicity and antimicrobial efficiency of Moringa oleifera seeds extracts

The cytotoxicity and antimicrobial activity of different Moringa oleifera seeds extracts were tested against Scenedesmus obliquus (green algae), Escherichia coli ATCC 13706, Pseudomonas aeruginosa ATCC10145, Staphylococcus aureus NAMRU 3 25923, Bacillus sterothermophilus (bacterial strains) and Herpes Simplex virus type 1 (HSV 1) and Polio virus type 1 (sabin vaccine). Fixed oil extracted from the seeds was found to activate the growth of Scenedesmus obliquus with high algal biomass production. Aqueous methanolic extracts (LC50 207.5 mg/L) and water extract (LC50 287.5 mg/L) has a cytotoxicity effect on Scenedesmus growth. On the other hand, the antibacterial effects of fixed oil, aqueous methanolic extract and water extract concentrations showed a fluctuation in its effects. Although, Ps. aeruginosa was more resistant to all M. oleifera extracts, B. sterothermophilus was more sensitive than other organisms to all extracts. The effect of aqueous methanolic extract and fixed oil on HSV1 was highly similar, 52.22% and 45.2%. Very low activity was observed for fixed oil on PV1.     

Oxidation of sulfamethoxazole and related antimicrobial agents by TiO2 photocatalysis

The widespread detection of pharmaceutically active compounds, including many synthetic antimicrobial agents, in aquatic environments is raising public health concerns. As a result, there is growing interest in the development of innovative technologies to efficiently transform these compounds to non-toxic and pharmaceutically inactive byproducts. This work examines the photocatalytic degradation of sulfamethoxazole (SMX) and related sulfonamide antimicrobial agents in aqueous suspensions of nanophase titanium dioxide (TiO(2)). Experimental results demonstrate that SMX is mineralized by TiO(2) irradiated with ultraviolet-A light (UVA: 324相似文献   

过氧乙酸对池塘水体的增氧抑菌抑藻效果研究

为寻找一种既安全可靠,又能增加水体溶氧、杀灭水体病原菌并改善水体环境的抑藻试剂,用多功能水质分析仪检测在10、20、30℃条件下,过氧乙酸(体积分数为15%)在池塘水和蒸馏水中的放氧效果。结果表明:温度越高放氧越快,但温度越高氧气的饱和量越低,气体外溢,故测出的溶解氧浓度数值较低;采用滤纸片法和二倍稀释法测定过氧乙酸和3种常用杀菌剂对6种常见水产病原菌(副溶血弧菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、沃氏葡萄球菌和腐生葡萄球菌)的抑菌效果,结果显示,抑菌效果依次为恩诺沙星>过氧乙酸>聚维酮碘>高锰酸钾;对暂养的黄丝藻藻华进行毒杀,结果显示,随着时间的延长,加入高浓度过氧乙酸的试验组水体开始混浊,藻丝体开始断裂,叶绿素a含量减少;各时段下,过氧乙酸浓度组叶绿素a含量明显低于对照组(P<0.05),随着时间的延长各浓度组超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量均呈先增长后下降的趋势,说明黄丝藻藻丝体受到了过氧乙酸的破坏,开始解体甚至死亡。研究表明,在水产养殖池塘中使用过氧乙酸,增氧、抑菌、抑藻效果明显。     

过氧乙酸对池塘水体的增氧抑菌抑藻效果研究

为寻找一种既安全可靠,又能增加水体溶氧、杀灭水体病原菌并改善水体环境的抑藻试剂,用多功能水质分析仪检测在10、20、30℃条件下,过氧乙酸(体积分数为15%)在池塘水和蒸馏水中的放氧效果。结果表明:温度越高放氧越快,但温度越高氧气的饱和量越低,气体外溢,故测出的溶解氧浓度数值较低;采用滤纸片法和二倍稀释法测定过氧乙酸和3种常用杀菌剂对6种常见水产病原菌(副溶血弧菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、沃氏葡萄球菌和腐生葡萄球菌)的抑菌效果,结果显示,抑菌效果依次为恩诺沙星>过氧乙酸>聚维酮碘>高锰酸钾;对暂养的黄丝藻藻华进行毒杀,结果显示,随着时间的延长,加入高浓度过氧乙酸的试验组水体开始混浊,藻丝体开始断裂,叶绿素a含量减少;各时段下,过氧乙酸浓度组叶绿素a含量明显低于对照组(P<0.05),随着时间的延长各浓度组超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量均呈先增长后下降的趋势,说明黄丝藻藻丝体受到了过氧乙酸的破坏,开始解体甚至死亡。研究表明,在水产养殖池塘中使用过氧乙酸,增氧、抑菌、抑藻效果明显。     

2个氨基膦酸酯类化合物的合成和抑菌活性研究

基于Kabachnik-Fields反应,反应原料亚膦酸二乙酯、苯甲醛分别与苯胺和对甲苯胺在无催化剂和溶剂,一定反应时间和温度条件下,一锅法合成了2个氨基膦酸酯类化合物(1和2),利用1H-NMR,13C-NMR和IR对化合物1和2进行了结构鉴定,命名为二乙基[(苯基)(苯胺基)甲基]膦酸酯(1)和二乙基[(苯基)(对甲苯胺基)甲基]膦酸酯(2)。对所合成的化合物1和2分别做了抑菌活性研究,选取2种细菌(枯草芽孢杆菌和大肠杆菌),3种真菌(Fusarium oxysporum, Llyonectria destructans和Neocosmospora rubicola)。结果表明,化合物1和2在测试浓度范围内分别对上述细菌和真菌表现出不同程度的抑制作用。     

H_2O_2对家蚕抗菌肽表达水平的影响

抗菌肽是昆虫免疫防卫系统产生的一类对抗外源性病原体的防御性多肽,具有分子量小、理化性能稳定和广谱抗菌的特性。为探索H2O2对家蚕抗菌肽表达水平的影响,本文利用半定量RT-PCR技术,通过给5龄第3天的家蚕幼虫注射外源H2O2,检测脂肪体组织中的6种抗菌肽在注射后6、12、24和48h4个不同时间点的转录表达情况。结果显示,与对照相比,6种抗菌肽在注射H2O2后均有不同程度转录表达,表明H2O2能够有效地诱导抗菌肽基因的表达,对家蚕抗菌肽的产生具有调控作用。     

新型胆酸缩氨基硫脲衍生物的合成与抗菌活性研究

通过甾酮与取代氨基硫脲缩合,合成了一系列新型的胆酸缩氨基硫脲衍生物.其结构均经1H NMR,IR,ESI-MS及元素分析所证实.此外,所有目标化合物都进行了对金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,绿脓杆菌,大肠杆菌的抗菌活性测试.化合物4b,4g和4h对绿脓杆菌和大肠杆菌都具有良好的抑制效果.