蟹源副溶血弧菌胞外蛋白酶的纯化与特性分析

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Cellulose离子交换柱层析等方法,从中华绒螯蟹Eriocheir sinensis弧菌病病原菌——副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的胞外产物中分离纯化出两种具有致病作用的胞外蛋白酶。相对分子质量为39 600的蛋白酶是一种金属蛋白酶,EDTA可抑制其活性,金属离子Cu2+、Mg2+、Fe2+对该酶有抑制作用,而Ca2+对其则有一定程度的激活作用;该酶在50⁶0℃下热稳定性最好,最适pH为9。而相对分子质量为20 000的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,EDTA对其酶活力几乎没有影响,但苯甲基磺酰氟(PMSF)可抑制其酶活性;该酶的最适温度为50℃,最适pH为8。     

田菁花粉过敏原的分离、纯化及鉴定

目的：初步分离、纯化及鉴定田菁花粉变应原蛋白。方法对田菁花粉粗提液进行提取,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对粗提液蛋白组分进行分离,并对其分子质量进行测定。收集10例过敏患者血清,通过免疫印迹法（Western-blotting）对花粉变应原成分进行鉴定,用离子交换层析对其变应原进行初步纯化,并通过免疫印迹法进行鉴定。结果田菁花粉有蛋白条带20余条,其中主要条带有12条,16、19和27 ku为其特异性的过敏原,其中16和19 ku 为其主要过敏原。田菁花粉通过离子交换层析纯化出变应原主要集中在Ⅳ和Ⅰ峰,其对应的分子质量为16和19 ku。结论初步分离、纯化及鉴定了田菁花粉变应原,为临床过敏性疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

一步法分离石蜡切片DNA的改进与鉴定

目的改进一种以含蛋白酶K的裂解液作用于石蜡包埋处理的细胞、分离DNA粗提液用于PCR扩增的实验方案。方法石蜡包埋组织切片经常规脱蜡处理,用蛋白酶K裂解液洗脱细胞,55℃消化3 h后离心,吸取上清液;分光光度法检测DNA酶裂解液质量和浓度;以之为模板分别扩增人线粒体基因微卫星多态D310区、ATPase6基因区和核基因HBB、BRCA1等的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增情况,并测序验证扩增产物。结果以石蜡切片的DNA裂解粗提液为模板,扩增目的 DNA片段阳性率可达100%;获得序列分析验证。结论改进的蛋白酶K裂解液一步洗脱消化法操作简单、过程快捷、费用低廉,能快速有效地分离石蜡组织切片DNA,用于后续PCR扩增检测,具有较高效率。     

正交试验法优选蚓激酶提取工艺研究

目的:优选蚓激酶提取工艺参数。方法:以赤子爱胜蚓为原料,通过正交试验法,以酶的活性为指标,考察缓冲液p H值、第一次盐析和第二次盐析的饱和度对提取效果的影响,得到蚓激酶粗品经凝胶层析、离子交换层析、透析、超滤等工序制备高活性蚓激酶。结果:在缓冲液p H7.5,第一次盐析硫酸胺饱和度为40%,二次饱和度为80%时,蚓激酶比活达3327 u/mg。结论:该提取工艺稳定性好,酶活性高。     

海洋假交替单胞菌CI4菌株抗菌蛋白分离纯化的初步研究

将海洋假交替单胞菌Pseudoaltermonas sp.CI4菌株于VNSS液体培养基中培养,获得浓缩无细胞上清液,采用纸片扩散法检测其抗菌活性。结果表明,该菌株的胞外产物能够抑制从岩石表面分离的污损细菌S1菌株和其自身的生长。除去菌体培养液,用饱和度为70%的硫酸铵沉淀,所得的拮抗物粗提液对热部分敏感,对蛋白酶K和链霉蛋白酶敏感,其作用的活性pH稳定范围为5.0⁹.0。粗提液经Sephadex G-200柱层析、DE-52纤维素离子交换柱层析,Microcon离心超滤管分级和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)跟踪检测,得到电泳纯抗菌蛋白,其相对分子质量为37 200。     

解淀粉芽孢杆菌KN-BL-1及其发酵豆粕产抗菌肽类物质的研究

以牛津杯法比较解淀粉芽孢杆菌KN-BL-1及其发酵豆粕的抑菌效果,通过酸沉淀法分离粗多肽,确定产生抑菌效果的为多肽类物质,通过DEAE-Sepharose离子交换层析及Sephadex G-25凝胶过滤层析分离纯化粗多肽以研究其各组分的抑菌效果,并使用4000 Q TRAP液相色谱-质谱联用仪初步确定抗菌肽样品的分子量范围。结果表明,KN-BL-1及其发酵豆粕浸提液对S.aureus等革兰氏阳性菌均有明显的抑菌效果;粗多肽经过层析分离纯化后,三个峰表现抑菌特性,其中有一个抑菌效果最好,抑菌圈清晰,直径为19.8 mm。     

转基因玉米中植酸酶蛋白免疫亲和纯化体系的建立

为深入研究转基因玉米所表达的植酸酶蛋白的酶学性质,评价重组蛋白的致敏性和饲用安全性,必须获得高纯度植酸酶蛋白。利用识别4个不同表位的单克隆抗体制备了植酸酶蛋白亲和层析体系。结果显示,通过80%硫酸铵沉淀植酸酶蛋白粗提液初步浓缩目的蛋白后,再经过透析去除高浓度盐离子,进而通过免疫亲和层析可获得在SDS-PAGE胶上条带单一的植酸酶蛋白,比活可达470.99 U/mg。同时,将上述免疫亲和层析法对植酸酶的纯化效果与离子交换层析方法进行了对比,结果表明免疫亲和层析法具有稳定、快速和纯化产物比活高等优势,所获得的目的蛋白满足各种检测要求,优于离子交换层析方法。     

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HDYM-03亚麻脱胶粗酶液性质研究

以果胶为单一碳源,对分离自温水沤麻液中的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HDYM-03进行产酶发酵试验,探究脱胶酶粗酶液的酶学性质。研究表明:该粗酶液中的果胶酶和β-甘露聚糖酶的最适pH值分别为6.0和4.0,最适温度均为40℃,二者在pH值为4.0~6.0和30~40℃条件下保存0~60 h时,果胶酶能保持较高活力。     

白花鬼针草花粉过敏原的分离鉴定与纯化

目的提取和分离纯化白花鬼针草花粉主要过敏原,并鉴定主要过敏原的致敏性。方法提取白花鬼针草花粉蛋白粗提液,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离粗提液蛋白组分并测定其分子质量,经离子交换层析法分离纯化几类主要的蛋白,Western blotting分别检测其与花粉过敏患者血清IgE结合情况及10位正常人阴性混合血清结合情况,对比鉴定每种主要蛋白质致敏原的致敏性。结果 SDS-PAGE结果示：在12.5-120ku之间广泛分布了20余条蛋白条带,其中主带7条,分子质量在35-70ku和10-15ku的区带蛋白含量最为丰富,余下的范围内还有约10余条次带。Westen-blotting检测示：白花鬼针草花粉变应原的致敏性强,与花粉过敏患者血清特异性IgE结合大。离子交换层析出6类主要变应原蛋白,其分子质量分别为70、65、54、49、39及33ku;阴性对照组Westen-blotting在70ku处有弱显色。结论白花鬼针草花粉的主要过敏原为70、65、54、49、39及33ku;70ku变应原致敏性最强。     

一种重组人睫状神经营养因子突变体的分离纯化及结构鉴定

研究并建立从细胞破碎上清中获得一种含游离半胱氨酸的重组人睫状神经营养因子突变体(CNTF-C17)的分离纯化方法并对纯化产物的结构及活性进行表征。通过疏水层析、离子交换和亲和层析的组合层析路线,能实现目标蛋白与其它杂蛋白的有效分离。组合层析后CNTF-C17的纯化倍数可达11.4,收率35.5%。反相高效液相色谱和凝胶过滤层析证明产物纯度可达到98%以上,且以单体形式稳定存在,无分子间二硫键结合的二聚体。质谱测得产物分子量与理论值一致,圆二色光谱和荧光光谱证明纯化产物具有正确的二、三级结构,TF-1.CN5a.1细胞增殖活性检测表明纯化产物比活达到2.1×106IU/mg。因此,为这种新的CNTF突变体规模化生产及后续应用奠定了基础。