不同保存方法对武汉单极虫DNA提取和PCR扩增的影响

为探讨不同保存方法对武汉单极虫Thelohanellus wuhanensis DNA提取和PCR扩增的影响,将从患武汉单极虫病的异育银鲫Carassius auratus gibelio鱼苗上分离出含有孢子的孢囊,分别置于100%乙醇、70%乙醇、2.5%戊二醛、10%福尔马林、Bouin's液、Carnoy's液和Müller's液中保存50 d,经计数调整孢子等量后分别进行DNA提取、常规PCR和巢式PCR扩增。结果表明:100%乙醇和70%乙醇保存方法对武汉单极虫孢子DNA提取、常规PCR和巢式PCR扩增均无任何影响,等同于新鲜孢子,可作为孢子的保存方法;2.5%戊二醛和Bouin's液保存方法只对孢子DNA提取有影响,但均能在常规PCR和巢式PCR扩增后出现特异电泳条带,可作为用于常规PCR和巢式PCR扩增的孢子保存方法;10%福尔马林和Müller's液保存方法对孢子DNA提取和常规PCR扩增均有影响,但均能在巢式PCR扩增后出现特异电泳条带,故只能作为用于巢式PCR扩增的孢子保存方法;Carnoy's液保存方法无论在孢子DNA提取还是进行常规PCR和巢式PCR扩增均无阳性结果,故不能用作孢子核酸分子生物学研究的保存方法。研究表明,除100%乙醇和70%乙醇保存方法外,其他保存方法对孢子DNA提取、常规PCR和巢式PCR扩增均有不同程度的影响。     

泡球蚴福尔马林固定标本的分子生物学鉴定方法

目的用分子生物学的方法对福尔马林固定液中浸泡的泡球蚴标本进行鉴别诊断。方法从感染了多房棘球绦虫的大鼠体内提取泡球蚴病理组织,用福尔马林固定液分别浸泡6个月和12个月,将经浸泡后的组织提取DNA,用多房棘球绦虫的特异性引物Em H15/17进行扩增,与多房棘球绦虫的线粒体12S RNA序列对比,从而进行虫种鉴定。结果在扩增的43例样本中,福尔马林固定液中浸泡6个月和12个月的泡球蚴组织分别有25例和18例,经PCR扩增后比对,发现均与多房棘球绦虫具有相同的序列。结论用这种分子生物学的方法,可以使保存于福尔马林固定液中鼠来源的泡球蚴标本得到较满意的鉴定。预示这种方法对于人体来源的泡球蚴福尔马林固定标本的分子鉴定工作具有可行性。     

一步法分离石蜡切片DNA的改进与鉴定

目的改进一种以含蛋白酶K的裂解液作用于石蜡包埋处理的细胞、分离DNA粗提液用于PCR扩增的实验方案。方法石蜡包埋组织切片经常规脱蜡处理,用蛋白酶K裂解液洗脱细胞,55℃消化3 h后离心,吸取上清液;分光光度法检测DNA酶裂解液质量和浓度;以之为模板分别扩增人线粒体基因微卫星多态D310区、ATPase6基因区和核基因HBB、BRCA1等的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增情况,并测序验证扩增产物。结果以石蜡切片的DNA裂解粗提液为模板,扩增目的 DNA片段阳性率可达100%;获得序列分析验证。结论改进的蛋白酶K裂解液一步洗脱消化法操作简单、过程快捷、费用低廉,能快速有效地分离石蜡组织切片DNA,用于后续PCR扩增检测,具有较高效率。     

洛阳市区猪源肉孢子虫调查及分子病原鉴定

为了了解市售猪肉中肉孢子虫(Sarcocystis)的感染情况和病原种类,随机采集164份洛阳市区不同超市和菜市场销售的新鲜猪瘦肉,利用直接压片镜检法进行肉孢子虫包囊的初步观察。提取包囊阳性肉样的基因组DNA,用基于18S rRNA序列的肉孢子虫属特异性引物,对阳性样品基因组DNA进行巢式聚合酶链反应(PCR)扩增和序列分析。分析结果表明:所采集的164份样品中,镜检肉孢子虫包囊阳性44份,总检出率为26.8%,多为轻度或中度感染。肌肉中包囊呈棒状或梭形,大小为(367~1 976)μm×(176~246)μm。镜检阳性样品用巢式PCR进一步鉴定,均为阳性。从中挑取阳性样品21份测序,所测得14份样品的18S rRNA序列与Gen Bank数据库中米氏肉孢子虫(S.miescheriana)序列相似度最高,达99%以上。说明洛阳市区市售猪肉中肉孢子虫感染率高,感染主要虫种为米氏肉孢子虫。     

碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用

目的:应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶(COX)亚型基因敲除小鼠,为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法:取子代小鼠耳缘组织于EP管中,用碱性裂解液提取基因组DNA,PCR扩增COX-1和COX-2基因片段,通过琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型作出鉴定。结果:碱性裂解液法提取的DNA能应用于子代小鼠的不同基因型的鉴定,即野生型(COX-1+/+;COX-2+/+)、杂合子(COX-1+/-;COX-2+/-)和纯合子(COX-1-/-;COX-2-/-)。结论:建立了碱性裂解液提取DNA法,并将该法成功应用于环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中。     

AIS大家系的AR突变效应分析

目的:分析雄性激素不敏感综合征(AIS)大家系的AR突变效应。方法:从AIS患者外周血中将基因组DNA提取出来,以特异的引物聚合酶联反应(PCR)扩张雄激素受体(AR)基因,单链构象多态性分析(SSCP)扩增产物,将突变的外显子筛选出来,然后对其直接进行PCR产物测序。结果:所选取的8例人员中,有2例AIS患者缺失AR基因2号外显子,其余6例存在外显子电泳条带,经过基因测序,发现其符合正常AR基因。结论:本研究方法简便实用,在临床诊断和研究AIS中具有极为有益的应用。     

几种单头螨线粒体基因组提取方法的比较

目的:比较几种单头螨线粒体基因组提取方法。方法:参考文献的方法,分别用酚氯仿抽提法、Chelex-100抽提法和蛋白酶K法提取单头螨的总DNA,用COⅠ引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳,比较不同抽提方法的结果。结果:酚氯仿抽提法未能扩增出目的基因,而Chelex-100抽提法和蛋白酶K法均成功扩增出了目的基因。结论:Chelex-100抽提法和蛋白酶K法均可用于单头螨线粒体基因的提取,前者获得的模板量大于后者,但是提取效率小于后者。     

虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的PCR检测方法

强壮弧菌Vibrio fortis是虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的一种致病菌。为建立强壮弧菌的PCR检测方法,根据强壮弧菌gyrB基因的高度变异区序列设计引物,筛选出特异性强的3对引物VF-6、VF-7及VF-8,分别对强壮弧菌S0907及20株参比菌株进行PCR扩增,结果显示,3对引物均对强壮弧菌扩增出与预期大小一致的目的基因片段且参考菌株无扩增条带。以不同稀释度的菌悬液制备的DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低细菌浓度分别为4.1×104、4.1×103、4.1×102 cfu/mL;对不同稀释度的细菌DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低DNA含量分别为1.4、0.14、0.014 pg/μL。试验结果表明:3对引物的特异性均较好,但灵敏度存在差异,其中以VF-8为引物的PCR检测方法最佳;使用以VF-8为引物的PCR检测方法对实验室养殖海胆及其生境样品进行初步检测,健康海胆、养殖海水及投喂的海带均为阴性,而自然海域海水中带有一定量的强壮弧菌。     

药理效应法评价胃康漂浮缓释片的提取方法

目的优选胃康漂浮缓释片的最佳提取溶媒。方法用3种方法配制不同的混悬液,即以8倍量水为溶媒煎煮提取药材(黄连∶吴茱萸=6∶1)2 h,提取液滤过,制成水煎液;以65%乙醇为溶媒同法提取药材(黄连∶吴茱萸=6∶1),提取液回收乙醇至无醇味,制成乙醇提取液;将上述比例的药材粉碎,过80目筛,加水制成混悬液。各组小鼠连续灌胃上述3种药液5 d,末次给药1 h后,以热板法考察3种药液给药后的镇痛作用。结果各组均能延长小鼠的痛阈值,其中醇提液痛阈提高百分率最大。结论选择的最佳提取溶媒为65%乙醇。     

多重连接依赖的探针扩增方法对原发性智力低下患儿进行亚端粒重排分析

目的 了解原发性智力低下伴单发或多发畸形患儿中染色体亚端粒重排的发生率,寻找智力低下的致病原因.方法 180例符合本组入选标准的原发性智力低下患儿,抽取外周血,乙二胺四乙酸钠(EDTA)抗凝.提取基因组DNA并进行纯化.用多重连接依赖的探针扩增(MLPA)方法的试剂盒P036B/C和P070进行检测,对使用2个试剂盒均存在相同异常的样本,再选用针对异常区域特异性的试剂盒P096、P064和P023鉴定或判断发生异常片段的大小.MLPA主要实验步骤包括:DNA变性、分子杂交、连接反应和特异PCR扩增,扩增的PCR产物用ABI 3100测序仪进行基因型分析,最终所得数据用GeneMarker软件进行分析.结果 在180例原发性智力低下患儿中发现13例存在染色体亚端粒重排(7%):其中12例为致病性,均为新生突变;1例2号染色体长臂末端缺失(2qdel)来源于表型正常的父亲.结论 亚端粒重排是原发性智力低下伴单发或多发畸形的致病原因.