大口黑鲈鱼种弹状病毒病的诊断

对广东佛山一突发批量急性死亡现象的大口黑鲈Micropterus salmoides养殖池塘中的患病大口黑鲈鱼种进行了研究。结果表明:濒死的大口黑鲈在水面漫游,烂身、烂鳍,停止摄食,严重者体色发黑;解剖病鱼鳃有少量出血点,肝脏严重肿大、充血,脾脏肿大,胃肠空虚,肾脏肿大;流行病学调查发现,该病具有明显的传染性;从病鱼肝脏、脾脏和肾脏中未分离到致病菌,也未检测到大量寄生虫;组织病理切片观察发现,肝脏、脾脏和肾脏均呈弥漫性坏死;参考Gen Bank中弹状病毒的基因序列,设计并合成检测引物,以从自然发病鱼提取的DNA作为模板,检测结果显示,病鱼均能扩增出与预期大小片段相符的特异性产物;经过克隆测序比对显示,扩增条带的基因序列与杂交鳢弹状病毒(HSHV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)核苷酸序列同源性分别为96.9%、95.3%。因此,初步诊断引起大口黑鲈鱼种急性死亡的病原为弹状病毒。     

斑点叉尾鮰暴发性海豚链球菌病的研究

于2006—2007连续两年在广西横县、邕江及合浦等网箱养殖的斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus中暴发一种流行性传染病,该病波及面广、传染性强,死亡率为30%¹00%。鱼的主要发病症状为:浮头、转圈、狂游,发病后期鱼的单边眼睛浑浊、突出,且全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型的斑点叉尾鮰的脑、肝脏、脾脏和肾脏组织等部位取样,分离到7株代表性菌株(CMS003100%。鱼的主要发病症状为:浮头、转圈、狂游,发病后期鱼的单边眼睛浑浊、突出,且全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型的斑点叉尾鮰的脑、肝脏、脾脏和肾脏组织等部位取样,分离到7株代表性菌株(CMS003^CMS005、CMS009CMS005、CMS009^CMS012)。人工感染试验结果表明,分离菌株对健康斑点叉尾鮰具有很强的致病力,发病症状与自然发病斑点叉尾鮰的症状相同。采用常规形态、生理生化及海豚链球菌Streptococcus iniae特异性PCR诊断和16S rRNA基因序列系统发育进化分析的方法,对分离菌株进行分类鉴定,结果表明,分离的7株细菌均为海豚链球菌。目前,海豚链球菌已成为广西斑点叉尾鮰网箱养殖的高致病性病原菌。     

黄颡鱼免疫球蛋白M基因的克隆与组织表达分析

根据GenBank中登录的免疫球蛋白M(IgM)基因编码氨基酸的保守序列以及鱼类密码子的偏好性设计简并引物,提取黄颡鱼Peltebagrus fulvidraco脾脏总RNA,经RT-PCR扩增首次获得了黄颡鱼IgM的部分序列(675 bp)。以β-actin为内参基因,通过Real-time PCR法分析了黄颡鱼IgM基因的组织分布特点。结果表明,在黄颡鱼肝胰脏、脾脏、头肾、中肾、鳃、肌肉、皮肤和肠道中均检测到IgM基因的表达,头肾和脾脏是IgM表达的主要部位,肾脏、鳃、皮肤、肠道和肝胰脏等组织中表达量居中,肌肉中表达量最低。经鮰爱德华菌Edwardsiella ictaluri胞外产物免疫后,头肾、脾脏和肝胰脏中IgM基因表达呈现不同的变化规律。     

TGEV和PEDV的多重PCR方法在猪传染性胃肠炎病毒检测中的应用研究

目的:通过应用同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的多重RT-PCR方法,并对其进行特异性与敏感性试验。方法:对本地区150份临床疑似病毒性腹泻病料进行检测,检测了仔猪腹泻的粪便或小肠组织共150份病料。在实验室检测中,此方法能检测约50 TCID50的混合病毒,能够扩增出3条长度为750 bp(PEDV)、544 bp(TGEV)、275 bp(PARV)特异性片段,而其它病毒无特异性条带。结果:PEDV、TGEV阳性率分别为54.67%(82/150)、8.0%(12/150)。PEDV与TGEV混合感染率为5.33%。结论:同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的多重RT-PCR方法的应用对临床上进行这两种疾病混合感染的检测具有重要意义。     

双斑东方鲀海盘虫病病原鉴定和鳃组织病理观察

海盘虫Haliotrema sp.病是双斑东方鲀Takifugu bimaculatus养殖生产上主要致死性病害之一，为深入了解该病，本研究中从2016年6月—2019年6月对池塘养殖的双斑东方鲀海盘虫病发病情况进行调查，利用形态学观察、几丁质结构特征分析和分子生物学技术对病原虫体进行鉴定与分析，并观察病鱼鳃组织病理变化。结果表明：该病春末夏初和秋季易发，发病时病鱼主要症状为缓游于水面，食欲减退或不摄食；体色苍白，体形消瘦，尾鳍、臀鳍缺损，鳃丝上有大量海盘虫虫体，鳃片黏液多，肝脏、脾脏充血；病原虫体经形态学观察和几丁质结构特征分析，鉴定为双裂海盘虫H.bilobatus,双斑东方鲀为其宿主新记录；对该虫体18S rDNA和28S rDNA(C1～D2区)基因片段扩增测序分析显示，其18S rDNA序列(1 282 bp)与栉齿刺尾鲷海盘虫H.ctenochaeti、丝蝴蝶鱼海盘虫H.aurigae等序列相似，一致性达97.68%～98.30%,其28S rDNA序列(886 bp)(C1～D2区)与镰茎海盘虫H.sicklocirrus序列最相似，但一致性仅达90.28%;基于18S rDNA和28S rDNA序列构建的系统发育树均显示，双裂海盘虫单为独立分支，为NCBI基因数据库未登记海盘虫属虫种；鳃组织病理学观察发现，虫体寄生导致双斑东方鲀鳃丝机械损伤、鳃上皮组织增生或脱落，甚至引起鳃组织病变、出血，重度感染会引发鳃小片坏死、崩解，大量黏液浸润鳃丝，从而使病鱼呼吸困难而死亡。研究表明，双裂海盘虫为福建池塘养殖双斑东方鲀海盘虫病的感染病原，该病春末夏初和秋季易流行。     

传染性造血器官坏死病毒毒株核蛋白基因片段的克隆及序列分析

利用RTG-2细胞对传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的敏感性对IHNV-DL进行扩增,采用TR-Izol法提取病毒RNA,用IHNV核蛋白基因的一对通用引物进行RT-PCR扩增,将扩增出的一条786 bp的基因纯化、克隆至pMD18-T载体中进行序列测定,并与国内外已公布的病毒核蛋白基因进行比对和分析。结果表明:此病毒的核酸序列与标准毒株RB-1、代表毒株WRAC的同源性分别为96.3%和93.6%;翻译出的氨基酸序列与标准毒株RB-1、代表毒株WRAC的同源性分别为96.1%和93.5%。系统进化树分析结果表明,此毒株与中国近期公布的毒株zyx有密切的亲缘关系。     

虹鳟传染性胰脏坏死病毒的分离鉴定及聚类分析

为研究传染性胰脏坏死病毒(IPNV)感染虹鳟Oncorhynchus mykiss的病理特性,取云南省某养殖场大规模死亡的虹鳟稚鱼进行了病原的分离与鉴定,试验中利用鲑鳟鱼常见病毒敏感细胞大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(Chinook salmon embryo cells,CHSE-214)、鲤上皮瘤细胞(Epitheliaoma papulosum cyprinid,EPC)和虹鳟性腺细胞(Rainbow trout gonad cell line,RTG-2)对虹鳟稚鱼无菌组织悬液进行病毒培养,并对产生细胞病变的上清进行病毒RNA提取及鲑鳟鱼常见病毒的RT-PCR检测,利用敏感细胞进行病毒分离株的噬斑培养及滴度测定,并对病毒形态进行透射电镜观察。结果表明:细胞培养显示,该组织悬液能使CHSE-214和RTG-2细胞产生明显的细胞病变;RT-PCR结果显示,检测样本呈IPNV阳性,传染性造血器官坏死病毒(IHNV)呈阴性;该IPNV分离株(命名为Ch Rtm213)在CHSE-214、RTG-2和EPC细胞上的病毒滴度分别为10^(5.2)、10(5.2)、10^(3.2)、10(3.2)、10^(2.3) TCID_(50)/m L,在CHSE-214细胞上培养4 d即可形成肉眼可见的病毒噬斑;在透射电镜下清晰可见大量病毒粒子呈晶格状排列于细胞质内;Ch Rtm213分离株与西班牙毒株2310(AY489225)VP2相似度较高,核苷酸序列一致性为96.4%;聚类分析结果显示,Ch Rtm213分离株与参考毒株加拿大Jasper(ATCC:VR-1325)聚为一簇,属于Gengroup 5基因型。研究表明,Ch Rtm213分离株异于已报道的IPNV分离株,具有不同的血清型及病毒毒力,可为传染性胰脏坏死病毒的检测及防控提供参考。     

虹鳟传染性胰脏坏死病毒的分离鉴定及聚类分析

为研究传染性胰脏坏死病毒(IPNV)感染虹鳟Oncorhynchus mykiss的病理特性,取云南省某养殖场大规模死亡的虹鳟稚鱼进行了病原的分离与鉴定,试验中利用鲑鳟鱼常见病毒敏感细胞大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(Chinook salmon embryo cells,CHSE-214)、鲤上皮瘤细胞(Epitheliaoma papulosum cyprinid,EPC)和虹鳟性腺细胞(Rainbow trout gonad cell line,RTG-2)对虹鳟稚鱼无菌组织悬液进行病毒培养,并对产生细胞病变的上清进行病毒RNA提取及鲑鳟鱼常见病毒的RT-PCR检测,利用敏感细胞进行病毒分离株的噬斑培养及滴度测定,并对病毒形态进行透射电镜观察。结果表明:细胞培养显示,该组织悬液能使CHSE-214和RTG-2细胞产生明显的细胞病变;RT-PCR结果显示,检测样本呈IPNV阳性,传染性造血器官坏死病毒(IHNV)呈阴性;该IPNV分离株(命名为Ch Rtm213)在CHSE-214、RTG-2和EPC细胞上的病毒滴度分别为10~(5.2)、10~(3.2)、10~(2.3) TCID_(50)/m L,在CHSE-214细胞上培养4 d即可形成肉眼可见的病毒噬斑;在透射电镜下清晰可见大量病毒粒子呈晶格状排列于细胞质内;Ch Rtm213分离株与西班牙毒株2310(AY489225)VP2相似度较高,核苷酸序列一致性为96.4%;聚类分析结果显示,Ch Rtm213分离株与参考毒株加拿大Jasper(ATCC:VR-1325)聚为一簇,属于Gengroup 5基因型。研究表明,Ch Rtm213分离株异于已报道的IPNV分离株,具有不同的血清型及病毒毒力,可为传染性胰脏坏死病毒的检测及防控提供参考。     

患上皮瘤病异育银鲫几种免疫相关酶活性的变化

通过对健康对照组、患上皮瘤病较轻组和严重组异育银鲫Allogynogenetic crucian carp的上皮(瘤)组织、血浆、肝脏、肾脏和脾脏中的碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物岐化酶(SOD)和溶菌酶(LSZ)活性进行测定和比较,研究了异育银鲫患上皮瘤病后免疫相关酶活性的变化规律。结果表明:AKP活性在上皮(瘤)组织、血浆和脾脏中除较轻组在血浆中与对照组无显著差异外,其余均显著高于对照组,严重组显著高于较轻组,而在肝脏和肾脏中较轻组和严重组均显著低于对照组,严重组显著低于较轻组;ACP活性在上皮(瘤)组织、血浆、肾脏和脾脏中除严重组在上皮(瘤)组织中与对照组无显著差异外,无论较轻组还是严重组患病鱼均显著高于对照组,而在肝脏中却显著低于对照组,在肾脏和脾脏中严重组显著高于较轻组;SOD活性在上皮(瘤)组织和血浆中只有严重组显著低于对照组,在肝脏、肾脏和脾脏中除严重组在肾脏中与对照组无显著差异外,无论较轻组还是严重组均显著高于对照组;LSZ活性在测定的5种组织中除较轻组在肝脏中与对照组无显著差异外,较轻组和严重组均显著低于对照组。研究表明,异育银鲫患上皮瘤病后,测定的4种免疫相关酶活性在不同组织中发生了上升或下降的变化,变化幅度与患病程度呈正相关关系。     

环介导等温扩增技术在水产病害检测中的研究与应用

病害的早期诊断是水产动物病害防治中的重要环节,传统的早期诊断主要通过生化反应和血清学试验来实现,该方法耗时久,要求操作人员具备一定的专业素质。随着分子生物学技术的快速发展,一种高效、简便且特异性强的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应运而生,LAMP是基于聚合酶链式反应和探针核酸检测技术的分子检测手段,可以检测动植物体内的病原菌、病毒、寄生虫和真菌等病原生物,在水产动物病原生物检测中应用广泛,如虹彩病毒(Iridovirus)、疱疹病毒(Herpesvirus)、爱德华氏菌属Edwardsiella、弧菌属Vibrio、黏孢子虫属Myxosporea、华支睾吸虫Clonorchis sinensis等。近年来该技术被不断改进,并被广泛应用于水产养殖动物的病害检测中,具有较广阔的发展前景。