基于COI条形码的根口水母科Rhizostomatidae水母分子系统进化研究

为探讨DNA条形码基因COI序列在根口水母科Rhizostomatidae水母物种鉴定中的有效性,分析了根口水母科3属6种水母及口冠水母科1属1种共计265条线粒体COI基因同源序列,利用MEGA 3.0计算根口水母科种内与种间的遗传距离,并基于邻接法(Neibour-Joining,NJ)、最大似然法(Maximum Likelihood,ML)和贝叶斯法(Bayesian,BI)构建了其分子系统进化树。结果表明:4个属7种水母种类COI基因同源序列长度为482 bp,种间遗传距离为0.065~0.235,平均遗传距离为0.198,种内遗传距离为0~0.032,平均为0.006,其中种间平均遗传距离(0.198)显著大于种内平均遗传距离(0.006),种间遗传距离是种内遗传距离的33倍;根口水母科水母种间遗传距离均大于Hebert推荐区分物种的最小种间遗传距离(0.02);采用NJ法、ML法和BI法构建的分子系统树拓扑结构基本一致,同一物种不同个体间均能聚成独立的单系群,表明COI基因可作为根口水母科水母种类准确鉴定的有效条形码基因;系统进化树显示,海蜇属为单系群,系统进化分析结果与形态分类学的观点并不十分一致。研究表明,COI基因序列在根口水母科不同阶元间变异较大,适合于根口水母科水母种类鉴定及群体水平的分子标记。     

仿刺参3个地理群体ITS1序列变异及系统发生分析

利用核糖体DNA第一内转录间隔区(Internal transcribed spacer 1,ITS1)序列,对中国大连(CD)、朝鲜罗津(KN)和俄罗斯海参崴(RV)仿刺参Apostichopus japonicus 3个群体的遗传结构进行分析。结果表明:经PCR扩增、克隆测序,获得长度为517⁵19 bp、524 bp两种类型的ITS1核苷酸序列,平均G+C含量(64.5%)显著高于A+T含量(35.5%);在仿刺参30个个体61条序列中共检测到49个变异位点,多态位点比例为9.33%,其中有4个简约信息位点,共有40种基因型,群体共享基因型为2个;遗传多样性分析表明,3个群体的遗传多样性丰富;分子方差分析显示,88.65%的变异来自于群体内部,群体间遗传分化较弱或中度分化;根据群体间遗传距离进行的聚类分析发现,KN群体与RV群体的亲缘关系较近,CD群体与KN、RV群体的亲缘关系较远。     

STGC3基因启动子生物信息学分析及载体构建

目的运用生物信息学预测并分析鼻咽癌抑癌基因STGC3启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体。方法采用生物信息学软件预测STGC3基因5'端上游调控区5 000 bp序列进行启动子预测与分析,克隆最有可能的启动子,构建萤火虫荧光素酶双报告基因重组质粒,重组质粒经MluⅠ和BglⅡ限制性内切酶酶切及测序鉴定。结果 STGC3基因5'端上游-3 046 bp至-46 bp区域内有启动子活性,在-2 992 bp至-69 bp间启动子分值达0.8以上,其中-845 bp至-795 bp间分值最高,达到1.0。在-1 140 bp和-774 bp处检测到GC盒信号;在-441 bp处检测到CAAT盒信号。在-1 805 bp至-1 705 bp和-900 bp至-684 bp间各有一个Cp G岛;在-2 348 bp和-948 bp处各有一个转录起始位点。经不同长度的片段缺失比对,取最有可能的283 bp(-1 360 bp至-1 077 bp)、281 bp(-934 bp至-653 bp)和571 bp(-500 bp至+72 bp)启动子片段构建p GL3-en283、p GL3-en281及p GL3-en571三种质粒,质粒经酶切测序,酶切片段大小一致,序列正确。结论根据生物物信息学分析结果,成功构建STGC3基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因表达载体,为双荧光素酶报告基因检测系统研究该基因启动子活性提供前期基础。     

直额裸腹溞线粒体DNA COⅠ基因的克隆及序列分析

为研究直额裸腹溞Moina rectirostris线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)基因的特点,使用WizardTM基因组DNA纯化试剂盒提取直额裸腹溞DNA,以其DNA为模板,用线粒体COⅠ基因通用引物进行PCR扩增、测序。结果表明:直额裸腹溞线粒体DNA COⅠ基因部分cDNA序列长度为709 bp,其中碱基A、G、T、C含量分别为26.23%、19.89%、38.50%、15.37%,A+T含量(64.74%)明显高于G+C含量(35.26%);将该基因的cDNA序列与裸腹溞科5个种的同源序列进行比对,并用邻接法(NJ)构建系统进化树,结果显示,直额裸腹溞与短型裸腹溞的遗传距离最小,同属于一个分支,亲缘关系最近。研究表明,应用COⅠ基因序列可以有效地区别裸腹溞科各个种类,与传统形态学分类学的结果基本一致。     

基于COI条形码的根口水母科Rhizostomatidae水母分子系统进化研究

为探讨DNA条形码基因COI序列在根口水母科Rhizostomatidae水母物种鉴定中的有效性,分析了根口水母科3属6种水母及口冠水母科1属1种共计265条线粒体COI基因同源序列,利用MEGA 3.0计算根口水母科种内与种间的遗传距离,并基于邻接法(Neibour-Joining,NJ)、最大似然法(Maximum Likelihood,ML)和贝叶斯法(Bayesian,BI)构建了其分子系统进化树。结果表明:4个属7种水母种类COI基因同源序列长度为482 bp,种间遗传距离为0.065⁰.235,平均遗传距离为0.198,种内遗传距离为00.235,平均遗传距离为0.198,种内遗传距离为0⁰.032,平均为0.006,其中种间平均遗传距离(0.198)显著大于种内平均遗传距离(0.006),种间遗传距离是种内遗传距离的33倍;根口水母科水母种间遗传距离均大于Hebert推荐区分物种的最小种间遗传距离(0.02);采用NJ法、ML法和BI法构建的分子系统树拓扑结构基本一致,同一物种不同个体间均能聚成独立的单系群,表明COI基因可作为根口水母科水母种类准确鉴定的有效条形码基因;系统进化树显示,海蜇属为单系群,系统进化分析结果与形态分类学的观点并不十分一致。研究表明,COI基因序列在根口水母科不同阶元间变异较大,适合于根口水母科水母种类鉴定及群体水平的分子标记。     

马蓝与路边青的matK序列差异与分子鉴定方法分析

目的:研究拟基于mat K序列分析,探讨马蓝与路边青相互鉴别的新方法。方法:从Gen Bank核酸数据库下载马蓝与路边青mat K序列,应用Clustal X 2.1软件进行SNP鉴别位点分析,应用MEGA5.0软件计算种内和种间的(K2P)遗传距离,并构建邻接(NJ)系统聚类树。结果:获得8个马蓝mat K序列及12个路边青mat K序列,分析显示马蓝与路边青的mat K序列具有近百个SNP位点,且其中多是马蓝与路边青特有的,可作为二者间相互鉴别的分子标记。且马蓝的最大种内K2P遗传距离0.001与路边青最大种内K2P遗传距离0.005均远远小于马蓝与路边青的种间K2P遗传距离0.144~0.149,构建的系统发育树显示马蓝与路边青单独聚为一类。结论:mat K序列可为马蓝与路边青的相互鉴别提供新的分子鉴定方法。     

刺参多功能表皮生长因子6(megf6)cDNA克隆及在肠再生过程中的表达分析

为了探究刺参Apostichopus japonicus多功能表皮生长因子6(multiple epidermal growth factor 6)的生物学信息和功能,利用RACE技术克隆了体质量为(92.0±4.0)g的成体刺参megf6基因(Aj-megf6)cDNA全长序列,并分析了该基因的信息学特征及其在肠再生过程中表达水平的变化。结果表明:刺参megf6基因的cDNA序列全长为5665 bp,共编码了1604个氨基酸,具有37个EGF样结构域;该基因编码蛋白的相对分子质量为172 500,理论等电点为4.74,该蛋白具有信号肽,为分泌蛋白,属于亲水性、非跨膜蛋白,共有53个磷酸化位点,分别为23个Ser位点、12个Thr位点、18个Tyr位点;MEGF6氨基酸多序列比对发现,刺参MEGF6与其他物种的氨基酸序列一致性为38.59%～49.07%,其中与紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus的一致性最高,为49.07%,其次为长棘海星Acanthaster planci(48.71%);基于MEGF6氨基酸序列的系统进化树分析显示,刺参与紫球海胆、长棘海星聚为一支,该结果符合刺参的分类和进化地位,MEGF家族成员间比对分析显示,MEGF家族成员间具有一定的分化;实时定量PCR (qPCR)结果显示,在刺参肠再生过程中megf6 mRNA表达量呈先升高后降低的趋势,其中再生6 d时的表达量达到峰值,为对照组的126.47倍,再生18 d时降至正常水平。研究表明,刺参megf6基因的表达与刺参肠管形态的变化趋势相一致,推断megf6可能在刺参肠再生过程中发挥重要作用。     

牦牛DIO2基因克隆及其在骨骼肌的表达分析

为探索DIO2基因调控牦牛骨骼肌发育及肌纤维类型组成的潜在功能,克隆DIO2基因CDS序列并进行相关的生物信息学分析,以及比较分析其在牦牛骨骼肌的差异表达.结果显示,DIO2基因的CDS全长为789 bp,编码132个氨基酸.序列同源性比对及系统进化树分析发现,牦牛DIO2基因与普通牛的亲缘关系最近,核酸及蛋白序列与普通牛一致;与小鼠的亲缘关系较远,序列同源性仅为86.75%和87.12%,与原鸡的亲缘关系最远,二者的同源性分别为79.17%和76.30%.理化性质预测表明DIO2蛋白为不稳定疏水性蛋白,有跨膜结构域,具有24个磷酸化位点,蛋白结构为无规则卷曲、α-螺旋和延伸链三者交替出现.采用实时荧光定量PCR分析显示,DIO2基因在牦牛的脾、肺等内脏组织表达无显著差异;在背最长肌和半腱肌的表达量显著高于脂肪和肝脏组织(P<0.01).此外,DIO2在金川牦牛半腱肌的表达量显著高于麦洼牦牛(P<0.05).以上结果为研究DIO2在牦牛骨骼肌的功能提供参考资料.     

两种乌鲂科鱼类线粒体DNA片段序列的比较分析

为检测日本乌鲂Brama japonica与斯氏长鳍乌鲂Taractichthys steindachneri的种间遗传差异,对线粒体16S rRNA、细胞色素b(Cytb)和细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因片段序列进行了测定。经比对获得同源片段序列的长度分别为491、478、558 bp,其中16S rRNA基因片段上存在2处碱基插入/缺失。核苷酸组成分析结果表明:日本乌鲂与斯氏长鳍乌鲂在这3个基因片段上的G+C含量差异不显著(P>0.05)(平均为47.27%、46.59%),G含量均偏低,特别是在Cytb和COⅠ这两个基因的第三密码子位点上表现尤为突出(平均为9.80%、12.31%)。两种鱼类在线粒体基因组不同片段上的遗传差异比较明显,在总长度为1529 bp的核苷酸序列中,两种间共检测到204处核苷酸替换,两个蛋白质编码基因上的核苷酸替换主要发生在第三密码子位点上;两种鱼类在3个基因片段上的种间净遗传距离依次为0.112 7(16S rRNA)、0.166 4(Cytb)和0.135 3(COⅠ),遗传差异水平均达到属间差异水平。NJ系统树显示,斯氏长鳍乌鲂与小鳞异鲂Xenobrama microlepis的亲缘关系较近,而与日本乌鲂的亲缘关系较远。根据Cytb基因片段序列分析,日本乌鲂与斯氏长鳍乌鲂的分歧时间约为832万年,两种间分化事件发生在中新世。     

采用16S rRNA基因序列分析海扇贝与3种扇贝的亲缘关系

采用16S rRNA基因序列分析技术,对2005年引自加拿大的海扇贝Placopecten magellanicus以及中国现有种类——虾夷扇贝P.yessoensis、栉孔扇贝Chlamys farreri和海湾扇贝Argopecten irradians进行了遗传学比较分析。每个扇贝种群随机抽取2个个体,利用通用引物进行16S rRNA基因片段扩增并双向测序。所得序列去掉不可信位点后,得到433 bp的基因片段。序列比对分析得到306个变异位点,其中转换位点为124个,颠换位点为111个,既有转换又有颠换的位点为45个,插入和缺失为26个。核苷酸变异值及分子系统树结果表明,海扇贝与虾夷扇贝的亲缘关系较近。