鮰爱德华菌单克隆抗体的制备及其在黄颡鱼“红头病”研究中的应用

以黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco"红头病"病原——鮰爱德华菌Edwardsiella ictaluri A86为抗原,利用杂交瘤技术制备了鮰爱德华菌黄颡鱼分离株的菌体单抗5D11、1B8、1G7、3G8、5A9、3H8,其效价分别为1∶1280、1∶1280、1∶2560、1∶320、1∶160和1∶80。结果表明:6株单抗与11株鮰爱德华菌黄颡鱼分离株均可以结合,与迟缓爱德华菌、气单胞菌、大肠杆菌、链球菌、弧菌等10株参考菌株均无交叉反应,单抗5D11和1B8可与鮰爱德华菌参考菌株结合。应用免疫荧光和免疫组织化学法检测了鮰爱德华菌对黄颡鱼的侵染规律。结果表明:黄颡鱼经人工注射鮰爱德华菌A86感染6 h后,在其肝、肾、脾、心、肠和胃中检测到了阳性细菌,其中脾脏中最多,心脏中最少;感染24 h后,脑中检测到阳性细菌;30 h后,鳃中显示有阳性信号;54 h后,在眼的外边缘检测到少量阳性细菌。研究结果可为进一步研究鮰爱德华菌在黄颡鱼体内的致病机理提供技术手段及基础,对揭示黄颡鱼"红头病"的发病机制具有重要意义。     

肠道消化吸收相关因子对大黄鱼生长速度的影响

为了分析大黄鱼Pseudosciaena croce在人工养殖过程中,常常出现同一批次鱼苗在相同养殖条件下个体差异明显、部分鱼生长速度缓慢的原因,试验选取福州市连江县某鱼场同一网箱内同一批次投放的鱼苗,根据个体大小分组,体质量为60¹00 g的为生长正常组,体质量为10100 g的为生长正常组,体质量为10⁴0 g的为生长缓慢组,在相同养殖条件下饲喂300 d,试验结束时,采用消化酶活性检测、荧光定量PCR和石蜡组织切片3种方法,分别测定大黄鱼肠道的消化酶活性和菌群数量,观察肠道的组织形态学变化并进行对比分析。结果表明:两组鱼的各种消化酶活性均无显著性差异(P>0.05);在生长缓慢组鱼肠道内,酵母菌和弧菌等兼性厌氧菌数量高于生长正常组,且两组之间酵母菌数量有显著性差异(P<0.05);生长正常组鱼肠道绒毛密集、修长且完整,而生长缓慢组鱼肠道绒毛稀疏,有大量损伤,前肠上皮内淋巴细胞数量显著高于生长正常组(P<0.05)。研究表明,大黄鱼鱼群生长速度与肠道菌群及肠绒毛状态有关,而与肠道消化酶活性无关。     

白斑综合征病毒单克隆抗体的制备及BA-ELISA方法的建立

白斑综合征病毒(white spot syndrom virus,WSSV)是甲壳类动物的重要病原,作者采用提纯的WSSV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,共得到3株能特异分泌抗WSSV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞(1E9、1E10、4F5)。将3株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶104¹05。1E9、4F5的抗体亚型均为IgG1,1E10的抗体亚型为IgG2b。特异性实验表明:3株单抗与虾类病原桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、哈维氏弧菌(V.harveyi)均无交叉反应。Western bolt分析表明:单抗1E9与病毒28kD外膜蛋白特异性结合。采用生物素标记纯化后的单抗1E9,并建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(Biotin-Adivin ELISA,BA-ELISA)用于WSSV的检测,该方法对提纯病毒的检测灵敏度约为4 ng,对病虾血淋巴的检测灵敏度达1∶25000。     

两种致病性弧菌外膜蛋白抗原特性的分析

采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)和苯甲基磺酰氟(PMSF)两种方法提取两种海洋致病性弧菌——鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri和秦皇岛弧菌Vibrio qinhuangdaorasp.nov.的外膜蛋白,并应用SDS-PAGE分析了其外膜蛋白的构成。电泳图谱显示,相对分子质量为44 000、36 000、34 000、26 000、23 000的蛋白条带为两种弧菌外膜蛋白中的共有条带。采用Western-Blotting法比较了两种弧菌外膜蛋白抗原性的异同,结果表明,鱼肠道弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、43 000、34 000、32 000、28 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应;秦皇岛弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应。两种弧菌中均存在相对分子质量为46 000、26 000的外膜蛋白,且具有共同的抗原性。     

哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用

从致病性哈维氏弧菌Vibrio harveyi SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶(trxR)基因的1 133bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple。测序结果表明,目的片段含有960 bp trxR基因阅读框,编码为319个氨基酸残基的蛋白质。Blast分析结果显示,硫氧还蛋白还原酶蛋白氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列的相似性分别为99%、98%、96%、94%、92%。构建表达质粒pET-28a(+)/TrxR后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白的相对分子质量为34 000。用Ni琼脂糖亲和层析柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆Scophthalmus maximus,用ELISA法检测免疫1～4周内鱼血清中特异性抗体的效价。结果表明,特异性抗体效价持续升高,第2周则达到1∶128。免疫4周后用哈维氏弧菌SF1对大菱鲆进行人工感染,对照组鱼的死亡率为100%,免疫组鱼的死亡率为25%,相对免疫保护力为75%。试验表明,哈维氏弧菌TrxR蛋白具有较好的免疫原性,可作为潜在的亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。     

大豆分离蛋白替代鱼粉对哲罗鱼消化生理的影响

为研究大豆分离蛋白替代鱼粉后对哲罗鱼Hucho taimen消化系统组织结构和消化酶活性的影响,在水温为9. 8～16. 2℃时,将初始体质量为(6. 90±0. 04) g的哲罗鱼饲养于室内220 L玻璃钢水族箱中,分别投喂大豆分离蛋白替代0、25. 0%、37. 5%、50. 0%、62. 5%、75. 0%、87. 5%和100. 0%鱼粉的饲料,每个处理设3个重复,每个重复放100尾鱼,以含有40. 0%鱼粉的饲料为对照,试验时间为56 d。结果表明:随着鱼粉替代比例的增加,哲罗鱼胃、前肠、幽门盲囊、中肠和胰腺的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均呈显著下降趋势(P<0. 05);肠道绒毛和纹状缘高度亦呈显著下降趋势(P<0. 05);高比例替代鱼粉水平(>75%)时,哲罗鱼肠道组织结构完整性被破坏,纹状缘融合、部分脱落,肝脏空泡化现象严重,形态轮廓逐渐模糊,肝细胞核偏移,且溶解或缺失。研究表明,大豆分离蛋白高比例替代鱼粉水平(>75%)显著降低消化系统消化酶活性,损伤肝脏和肠道组织。     

奥尼罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

采用饱和硫酸铵盐析和Sephadex G-200柱层析方法制备奥尼罗非鱼Oreochromis niloticus×O.aureus(体质量为500～1 000 g)免疫球蛋白(IgM),以其为抗原免疫8周龄的BALB/c小鼠,免疫3～4次后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA方法对杂交瘤进行筛选。结果表明:阳性克隆经3次亚克隆后,共获得6株针对罗非鱼IgM的单克隆抗体(mAb),分别命名为1C10、1C2、1G11、2C2、2F9和4B3,所有单抗均为IgG类,各株杂交瘤的细胞上清ELISA效价为1∶800～1∶3 200;制备4B3和1G11的腹水单抗,ELISA效价分别为1∶102 400和1∶6 400。免疫印迹试验结果表明,mAb 4B3能在变性条件下识别罗非鱼IgM的重链,约在相对分子质量85 000左右。用ELISA检测4B3对罗非鱼IgM的敏感性,IgM灵敏度为10μg/L。利用所制备的单抗4B3建立了评价无乳链球菌Streptococcus agalactiae灭活疫苗免疫罗非鱼血清抗体水平的三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)方法,结果表明:腹腔注射和浸泡免疫无乳链球菌灭活疫苗14 d后,两种免疫方式的罗非鱼血清抗无乳链球菌的抗体比对照组稍有增加;免疫21 d后,两种免疫方式的罗非鱼血清抗体均有明显增加;免疫35 d后增加更为显著,达到最高峰,注射组效价达1∶2 560,浸泡组达1∶640;免疫56 d后抗体开始下降,直到第98天还维持在明显高于对照组的抗体水平。本研究表明,所制备的罗非鱼IgM mAb可用于评价罗非鱼疫苗免疫效果及抗体产生规律等,具有广阔的应用前景。     

育苗阶段虾夷扇贝幼体中可培养细菌的多样性

为了研究虾夷扇贝Patinopecten yessoensis育苗过程中5个发育时期(受精卵时期S1、担轮幼虫时期S2、D形幼虫时期S3、壳顶幼虫时期S4、稚贝时期S5)幼体所含可培养细菌的多样性,采用2216E平板涂布法,从每个发育时期的幼体样品中各分离出30株细菌,并对150株菌进行16S rRNA基因测序分析。结果表明:150株细菌归属于2门3纲8目12科16属39种;在门水平,5个时期幼体样品中变形菌门均为优势门,其次为厚壁菌门;在属水平,优势属为弧菌属(51/150)、假交替单胞菌属(43/150)、芽孢杆菌属(16/150)、交替单胞菌属(9/150),占总数的79.3%;其中弧菌属在S1(43.3%)、S2(36.7%)、S3(36.7%)时期均为优势属,在S1时期,次优势属依次为假交替单胞菌属(26.7%)、动性球菌属(10.0%)和枝芽孢杆菌属(6.7%),在S2时期,次优势属依次为假交替单胞菌属(23.3%)、亚硫酸杆菌属(20.0%)和芽孢杆菌属(13.3%),在S3时期,次优势属依次为假交替单胞菌(16.7%)、动性球菌属(13.3%)和交替单胞菌属(10.0%);假交替单胞菌在S4(36.7%)和S5(40.0%)时期均为优势属,在S4时期,次优势属依次为弧菌属(30.0%)、芽孢杆菌属(16.7%)和交替单胞菌属(10.0%),在S5时期,次优势属依次为弧菌属(23.3%)、芽孢杆菌属(16.7%)和Pontibacillus(10.0%)。研究表明,虾夷扇贝育苗过程中不同发育时期的幼体所含可培养细菌种类比较丰富,细菌群落结构存在较大差异。     

育苗阶段虾夷扇贝幼体中可培养细菌的多样性

为了研究虾夷扇贝Patinopecten yessoensis育苗过程中5个发育时期(受精卵时期S1、担轮幼虫时期S2、D形幼虫时期S3、壳顶幼虫时期S4、稚贝时期S5)幼体所含可培养细菌的多样性,采用2216E平板涂布法,从每个发育时期的幼体样品中各分离出30株细菌,并对150株菌进行16S rRNA基因测序分析。结果表明:150株细菌归属于2门3纲8目12科16属39种;在门水平,5个时期幼体样品中变形菌门均为优势门,其次为厚壁菌门;在属水平,优势属为弧菌属(51/150)、假交替单胞菌属(43/150)、芽孢杆菌属(16/150)、交替单胞菌属(9/150),占总数的79.3%;其中弧菌属在S1(43.3%)、S2(36.7%)、S3(36.7%)时期均为优势属,在S1时期,次优势属依次为假交替单胞菌属(26.7%)、动性球菌属(10.0%)和枝芽孢杆菌属(6.7%),在S2时期,次优势属依次为假交替单胞菌属(23.3%)、亚硫酸杆菌属(20.0%)和芽孢杆菌属(13.3%),在S3时期,次优势属依次为假交替单胞菌(16.7%)、动性球菌属(13.3%)和交替单胞菌属(10.0%);假交替单胞菌在S4(36.7%)和S5(40.0%)时期均为优势属,在S4时期,次优势属依次为弧菌属(30.0%)、芽孢杆菌属(16.7%)和交替单胞菌属(10.0%),在S5时期,次优势属依次为弧菌属(23.3%)、芽孢杆菌属(16.7%)和Pontibacillus(10.0%)。研究表明,虾夷扇贝育苗过程中不同发育时期的幼体所含可培养细菌种类比较丰富,细菌群落结构存在较大差异。     

地衣芽孢杆菌与低聚木糖对异育银鲫消化酶活性、肠道菌群及生长的影响

将180尾异育银鲫(allogygenetic cruc ian carp)随机分成3组,每组设3个重复,分别投喂3种饲料:基础日粮(Ⅰ组),在基础日粮中添加质量分数为0.02%的地衣芽孢杆菌Bacillus lichenifor-m is(Ⅱ组),在基础日粮中添加质量分数分别为0.01%的地衣芽孢杆菌和低聚木糖(Ⅲ组),共饲养75 d。结果表明:与Ⅰ组鱼相比,Ⅱ组鱼的增重率显著提高(P<0.05),其肠道食糜中蛋白酶、淀粉酶的活性及食糜中芽孢杆菌和乳酸杆菌的数量大大增加,大肠杆菌的数量显著降低(P<0.05);Ⅲ组鱼的增重率和肠道食糜中淀粉酶的活性显著提高(P<0.05),肠道食糜中大肠杆菌的数量显著降低(P<0.05),乳酸杆菌的数量有增加趋势;Ⅲ组鱼肠道食糜中蛋白酶的活性、芽孢杆菌和乳酸杆菌数量,比Ⅱ组鱼显著降低(P<0.05),大肠杆菌数量有降低趋势,同时,Ⅲ组鱼肝胰脏中蛋白酶的活性比其它两组显著提高(P<0.05),两组之间其他指标差异不显著。因此,在基础日粮中添加地衣芽孢杆菌和低聚木糖,可提高鱼体中消化酶的活性,有助于维持肠道内的微生态平衡,促进动物生长。