菲律宾蛤仔凝集素的分离纯化及抑菌活性研究

采用Cellulose DE52离子交换层析、Sephadex G-100分子筛层析及TSK G3000PWXL凝胶色谱柱HPLC从菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum中分离纯化出具有N-乙酰半乳糖酰胺(N-acetyl-D-galac-tosamine,GalNAc)和猪胃黏蛋白(Mucin from porcine stomach,PSM)特异性的菲律宾蛤仔凝集素(简称为MCL-T)。SDS-PAGE分析结果表明,MCL-T的相对分子量为148 000,含有62 000和36 000的亚基。抑菌试验结果表明,MCL-T对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis有较高的抑菌活性。对MCL-T中Trp残基、-S-S-、-SH以及Tyr残基进行化学修饰后,MCL-T对金黄色葡萄球菌的抑菌活性丧失;对其-S-S-进行化学修饰后,MCL-T对枯草芽孢杆菌的抑菌活性影响不大,而对其-SH、Trp残基和Tyr残基进行化学修饰后,MCL-T对枯草芽孢杆菌的抑菌活性丧失。研究表明,MCL-T肽链上的氨基酸残基状态与其抑菌活性有关。     

基于蛋白质组学的菲律宾蛤仔凝集素MCL-T抑制腐败希瓦氏菌机理研究

为探究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum凝集素(MCL-T)诱导产生及其抑制腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens的作用机制,以腐败希瓦氏菌刺激菲律宾蛤仔,并利用固相吸附分析MCL-T与腐败希瓦氏菌外膜蛋白(outer membrane proteins, OMP)的相互作用,利用非标记(Label-free)定量蛋白质组方法对MCL-T作用于腐败希瓦氏菌的蛋白质组进行分析。结果表明:注射比浸泡方式产生更多的MCL-T;MCL-T与腐败希瓦氏菌外膜蛋白结合具有浓度依赖性;MCL-T作用于腐败希瓦氏菌后,有74个蛋白质表达量变化显著,其中,16个蛋白质表达量上调,58个蛋白质表达量下调,这些差异表达蛋白质主要参与氨基酸生物合成途径、丙酮酸代谢途径、柠檬酸循环途径、氨酰-tRNA生物合成途径和碳代谢途径。研究表明,MCL-T是通过影响腐败希瓦氏菌体内氨基酸合成、丙酮酸代谢和柠檬酸循环等实现其抑菌作用。     

环境因子对菲律宾蛤仔吐出杂物的影响

在不同温度、盐度、pH和光照条件下,研究了4种因素对菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum快速净化的影响。结果表明:温度为15²0℃时,菲律宾蛤仔吐出杂物的速率较大,净化4 h后其吐出杂物的重量百分比达89.59%;盐度为2520℃时,菲律宾蛤仔吐出杂物的速率较大,净化4 h后其吐出杂物的重量百分比达89.59%;盐度为25³0时,蛤仔吐出杂物的速率较大,净化4 h后其吐出杂物的重量百分比达88.4%;pH为730时,蛤仔吐出杂物的速率较大,净化4 h后其吐出杂物的重量百分比达88.4%;pH为7⁸时,菲律宾蛤仔吐出杂物的速率较大,4 h后其吐出杂物的重量百分比达87.99%;菲律宾蛤仔处于黑暗条件时,其吐出杂物的速率较自然光照下大,4 h后其吐出杂物的重量百分比达85.92%。因此,快速净化菲律宾蛤仔的适宜条件应为:水温158时,菲律宾蛤仔吐出杂物的速率较大,4 h后其吐出杂物的重量百分比达87.99%;菲律宾蛤仔处于黑暗条件时,其吐出杂物的速率较自然光照下大,4 h后其吐出杂物的重量百分比达85.92%。因此,快速净化菲律宾蛤仔的适宜条件应为:水温15²0℃,盐度2520℃,盐度25³0,pH为730,pH为7⁸,且选择黑暗条件下进行。     

不同壳色菲律宾蛤仔免疫机能的比较研究

研究了不同壳色菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum的免疫能力,对野生斑马蛤(Zb)、珍珠白(Pw)、两道红(Tr)、两道白(Tw)、奶牛蛤(Co)5个不同壳色群体的相关免疫指标进行比较。结果表明:不同壳色蛤仔免疫指标表现出较大差异,其中Zb和Pw群体的细胞吞噬能力显著高于Co群体(P<0.05);Tr和Tw群体的溶菌酶(LYZ)活性显著高于其他3个群体(P<0.05);Co群体的酚氧化酶(PO)活性显著高于Tr群体(P<0.05);Pw群体的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于Tr和Co群体(P<0.05),Zb群体的SOD活性也显著高于Tr群体(P<0.05);各壳色蛤仔的血细胞总数和亮氨酸氨基肽酶(LAP)活性差异均不显著(P>0.05)。     

越冬期前后菲律宾蛤仔体成分变化研究

为研究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum的低温耐受机制,对采集于大连市金石滩体质量为(15.45±1.00)g的越冬期蛤仔生理生化物质(结合水、糖原、甘油、脂肪、脂肪酸和氨基酸)含量的变化进行了检测。结果表明:与越冬前相比,越冬期后菲律宾蛤仔的糖原和脂肪含量均显著降低(P<0.05),甘油含量则显著升高(P<0.05);脂肪酸C18∶0、C20∶4n-6、C22∶5n-6和C22∶5n-3含量显著降低(P<0.05),C20∶5n-3(EPA)含量显著升高(P<0.05);异亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸含量显著升高(P<0.05)。研究表明,蛤仔体成分的变化与其低温耐受能力存在密切联系,该研究可为菲律宾蛤仔越冬期管理提供理论参考。     

菲律宾蛤仔生长性状基因型与环境互作研究

为研究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum基因型和环境的相作效应,采用双列杂交方法构建了AA、AB、BB、BA 4个基因型家系遗传材料,分别在不同温度、盐度和养殖环境条件下养殖30⁴5 d,以壳长生长为指标分析基因型与环境互作遗传效应。结果表明:基因型与温度互作遗传效应中,温度对基因型存在显著影响(P<0.05),在20、24、28℃水温下,壳长生长由大到小分别为BB>BA>AB>AA,BA>AB>AA>BB,AA>BA>AB>BB,但温度与基因型互作效应不显著(P>0.05);基因型与盐度互作遗传效应中,盐度对基因型存在显著影响(P<0.05),在20、25、30盐度下,AA家系生长均显著快于BA、AB和BB家系(P<0.05),各盐度下壳长生长均依次为AA>AB>BA>BB,但盐度与基因型互作效应不显著(P>0.05);在室外土池、室内循环水槽、室内水桶3种养殖环境下,环境对壳长生长存在显著影响(P<0.05),各家系生长速度均为室外土池>室内循环水>室内水桶,环境对基因型也存在显著影响(P<0.05),各环境条件下BA、AA、AB家系生长速度均显著快于BB家系(P<0.05),壳长生长由大到小依次为AA>AB>BA>BB,且养殖环境和基因型的交互作用也存在显著影响(P<0.05),采用线性回归法对蛤仔4个基因型与养殖环境互作进行数据分析,得出了不同基因型的壳长增长率对环境的响应方法,回归系数所确定的各基因型对环境变化反应的灵敏程度顺序为BB>AB>BA>AA。本研究结果为蛤仔遗传育种工作提供了参考依据。     

不同地理群体菲律宾蛤仔生长发育的比较

于2007年6月—11月,对菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum莆田群体(PT)、大连群体(DL)和东京群体(DJ)的生长发育情况进行了比较。结果表明:菲律宾蛤仔3个群体的受精率、孵化率无显著差异(P>0.05);卵径、D形幼虫大小、单水管稚贝大小差异显著(P<0.05);附着规格、亲贝形态,PT群体与DL、DJ群体间差异显著(P<0.05)。浮游期间,幼虫生长速度依次为PT>DJ>DL,分别为(9.37±0.44)、(9.28±0.59)、(8.70±0.51)μm/d,PT、DJ群体与DL群体差异显著(P<0.05);9日龄时,PT、DL、DJ群体幼虫的存活率分别为(95.08±1.87)%、(85.22±3.34)%、(75.32±3.49)%,彼此间差异显著(P<0.05)。变态期间,3个群体幼虫的生长速度依次为PT>DJ>DL,分别为(2.54±0.39)、(2.37±0.52)、(2.05±0.45)μm/d,彼此间差异显著(P<0.05);变态率、变态时间、变态规格,PT群体与DL、DJ群体间差异显著(P<0.05)。室内培育阶段(20⁴0日龄),3个群体稚贝的生长速度依次为PT>DL>DJ,分别为(22.60±4.04)、(20.67±4.74)、(18.74±5.15)μm/d,PT、DL群体与DJ群体间差异显著(P<0.05);40日龄时,PT、DL、DJ群体稚贝的存活率分别为(87.07±4.29)%、(66.73±6.43)%、(35.75±4.84)%,彼此间差异显著(P<0.05)。室外养成阶段(8040日龄),3个群体稚贝的生长速度依次为PT>DL>DJ,分别为(22.60±4.04)、(20.67±4.74)、(18.74±5.15)μm/d,PT、DL群体与DJ群体间差异显著(P<0.05);40日龄时,PT、DL、DJ群体稚贝的存活率分别为(87.07±4.29)%、(66.73±6.43)%、(35.75±4.84)%,彼此间差异显著(P<0.05)。室外养成阶段(80¹60日龄),3个群体稚贝的生长速度依次为PT>DL>DJ,分别为(86.94±21.72)、(75.23±16.91)、(67.25±18.26)μm/d,彼此间差异显著(P<0.05);160日龄时,PT、DL、DJ群体幼贝的存活率分别为(90.21±4.68)%、(66.73±4.94)%、(56.98±6.58)%,彼此间差异显著(P<0.05)。     

菲律宾蛤仔生长性状基因型与环境互作研究

为研究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum基因型和环境的相作效应,采用双列杂交方法构建了AA、AB、BB、BA 4个基因型家系遗传材料,分别在不同温度、盐度和养殖环境条件下养殖30~45 d,以壳长生长为指标分析基因型与环境互作遗传效应。结果表明:基因型与温度互作遗传效应中,温度对基因型存在显著影响(P<0.05),在20、24、28℃水温下,壳长生长由大到小分别为BB>BA>AB>AA,BA>AB>AA>BB,AA>BA>AB>BB,但温度与基因型互作效应不显著(P>0.05);基因型与盐度互作遗传效应中,盐度对基因型存在显著影响(P<0.05),在20、25、30盐度下,AA家系生长均显著快于BA、AB和BB家系(P<0.05),各盐度下壳长生长均依次为AA>AB>BA>BB,但盐度与基因型互作效应不显著(P>0.05);在室外土池、室内循环水槽、室内水桶3种养殖环境下,环境对壳长生长存在显著影响(P<0.05),各家系生长速度均为室外土池>室内循环水>室内水桶,环境对基因型也存在显著影响(P<0.05),各环境条件下BA、AA、AB家系生长速度均显著快于BB家系(P<0.05),壳长生长由大到小依次为AA>AB>BA>BB,且养殖环境和基因型的交互作用也存在显著影响(P<0.05),采用线性回归法对蛤仔4个基因型与养殖环境互作进行数据分析,得出了不同基因型的壳长增长率对环境的响应方法,回归系数所确定的各基因型对环境变化反应的灵敏程度顺序为BB>AB>BA>AA。本研究结果为蛤仔遗传育种工作提供了参考依据。     

高温、低盐对菲律宾蛤仔免疫能力的影响

为查明温度(21、30℃)和盐度(7、15、32)互作对菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum免疫能力的影响,对不同温度和盐度条件下试验0、3、6、12、24、48、72 h时,体质量为(14.8±0.731)g蛤仔的血细胞数、血淋巴吞噬能力和渗透压,以及血清中溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(AKP)活性的变化进行了研究。结果表明:以各指标0 h水平为对照,常温常盐组(21℃,32)蛤仔各指标在0~72 h内虽有波动,但变化并不显著(P>0.05);各试验组蛤仔血细胞数有不同的变化趋势,72 h时,常温低盐组(21℃,7)蛤仔恢复初始水平,而常温中盐组(21℃,15)、高温中盐组(30℃,15)和高温常盐组(30℃,32)蛤仔血细胞数最终仍未恢复,高温低盐组(30℃,7)蛤仔虽在24 h时恢复初始水平,但在48 h时全部死亡;高温常盐组蛤仔吞噬能力先升高后降低在72 h时仍低于初始水平(P<0.05),2个中盐组和常温低盐组蛤仔吞噬活性最终恢复,而高温低盐组蛤仔吞噬活性在24 h时仍处于较高水平(P<0.05);各试验组蛤仔LZM活性在72 h时均显著高于初始水平(P<0.05);常温中盐组蛤仔AKP活性在3 h出现最大值,最终所有试验组AKP在72 h时恢复初始水平;2个中盐组和2个低盐组蛤仔渗透压均逐渐降低,而高温常盐组蛤仔渗透压逐渐升高,在72 h时均未恢复初始水平。研究表明,温度升高的同时降低盐度,将会对贝类免疫能力造成严重的影响,这可能是夏季滩涂贝类死亡率较高的一个重要原因。     

越冬期前后菲律宾蛤仔体成分变化研究

为研究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum的低温耐受机制,对采集于大连市金石滩体质量为(15.45±1.00)g的越冬期蛤仔生理生化物质(结合水、糖原、甘油、脂肪、脂肪酸和氨基酸)含量的变化进行了检测。结果表明:与越冬前相比,越冬期后菲律宾蛤仔的糖原和脂肪含量均显著降低(P<0.05),甘油含量则显著升高(P<0.05);脂肪酸C18∶0、C20∶4n-6、C22∶5n-6和C22∶5n-3含量显著降低(P<0.05),C20∶5n-3(EPA)含量显著升高(P<0.05);异亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸含量显著升高(P<0.05)。研究表明,蛤仔体成分的变化与其低温耐受能力存在密切联系,该研究可为菲律宾蛤仔越冬期管理提供理论参考。     

菲律宾蛤仔闭壳肌组织学及其蛋白特性

为探讨菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum的加工特性与肌肉蛋白质特性的关系,对菲律宾蛤仔闭壳肌的组织形态、肌原纤维蛋白(Myofibrillar,Mf)的分布特性,以及与其低温凝胶化相关的特性等进行了分析。结果表明:闭壳肌肌纤维具有高度同向性,横纹肌呈直线柱状,平滑肌呈螺旋柱状;利用SDSPAGE电泳对两种类型肌肉的蛋白分布分析显示,横纹肌肌浆蛋白组分中存在相对分子质量为23 000的差异蛋白,且溶出更多的粗丝蛋白,平滑肌的Mf组分中存在标志性蛋白Myorod,且副肌球蛋白含量高,肌球和原肌球蛋白含量低,肌动蛋白含量接近;整个闭壳肌Mf的溶解性依赖于离子强度和有无三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)的添加;Ca~(2+)-ATPase活性在中等离子强度(KCl浓度为0.30 mol/L)时最高,偏离中等离子强度后活性逐渐降低;参与交联的蛋白包括肌球蛋白、副肌球蛋白、原肌球蛋白,离子强度越高交联作用越显著。本研究结果可为探究经济贝类软体可食部位蛋白特性提供参考。     

菲律宾蛤仔闭壳肌组织学及其蛋白特性

为探讨菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum的加工特性与肌肉蛋白质特性的关系,对菲律宾蛤仔闭壳肌的组织形态、肌原纤维蛋白(Myofibrillar,Mf)的分布特性,以及与其低温凝胶化相关的特性等进行了分析。结果表明:闭壳肌肌纤维具有高度同向性,横纹肌呈直线柱状,平滑肌呈螺旋柱状;利用SDSPAGE电泳对两种类型肌肉的蛋白分布分析显示,横纹肌肌浆蛋白组分中存在相对分子质量为23 000的差异蛋白,且溶出更多的粗丝蛋白,平滑肌的Mf组分中存在标志性蛋白Myorod,且副肌球蛋白含量高,肌球和原肌球蛋白含量低,肌动蛋白含量接近;整个闭壳肌Mf的溶解性依赖于离子强度和有无三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)的添加;Ca⁽²⁺⁾-ATPase活性在中等离子强度(KCl浓度为0.30 mol/L)时最高,偏离中等离子强度后活性逐渐降低;参与交联的蛋白包括肌球蛋白、副肌球蛋白、原肌球蛋白,离子强度越高交联作用越显著。本研究结果可为探究经济贝类软体可食部位蛋白特性提供参考。     

4种壳色菲律宾蛤仔在低氧胁迫下的耐受能力比较研究

菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum对环境中溶氧剧烈的波动有较强的适应能力,为了探讨抗氧化酶和热休克蛋白在蛤蛤恣仔的低氧耐受过程中发挥的作用,以对低氧具有不同耐受能力的4种壳色蛤仔(野生蛤仔、斑马蛤、白蛤、白斑马蛤)为研究对象,比较了在1 mg/L的低氧胁迫条件下其抗氧化酶家族基因成员(TPx、CAT、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD)和热休克蛋白家族基因成员(HSP40、HSP75、Vps HSP-1、Vps HSP-2)的表达量变化情况。结果表明:在鳃组织中,野生蛤仔的抗氧化酶基因表现出先升高后恢复的趋势,在胁迫后6 h时表达量达到最高值(P<0.05),其他3种壳色蛤仔的抗氧化酶基因表现出先降低后恢复的趋势,在胁迫后6 h时表达量达到最低值(P<0.05),斑马蛤的TPx基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05);在外套膜组织中,4种壳色蛤仔中的抗氧化酶基因均表现出先升高后恢复的趋势,白蛤TPx基因和白斑马蛤CAT基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05);在鳃组织中,斑马蛤和白斑马蛤中热休克蛋白家族基因成员表现出先降低后升高再降低的趋势,分别在24 h、6 h时达到最低值(P<0.05),野生蛤仔和白蛤中热休克蛋白家族基因成员表现出先升高后降低的趋势,在胁迫6 h时,白蛤热休克蛋白家族基因成员表达量达到最高值(P<0.05),胁迫12 h时,野生蛤仔达到最高值(P<0.05);在外套膜组织中,白斑马蛤中热休克蛋白家族基因成员表达量出现先降低后升高的趋势,在胁迫6 h时达到最低值(P<0.05),而其他3个壳色蛤仔中热休克蛋白家族基因表达量表现出先升高后降低的趋势,在胁迫6 h时野生蛤仔和白蛤热休克蛋白家族基因成员表达量达到最大值(P<0.05),12 h时斑马蛤达到最大值(P<0.05),且白蛤HSP40基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05)。研究表明,斑马蛤和白蛤的TPx基因可能参与其体内黑色素合成的过程,初步证实了不同壳色蛤仔参与色素合成过程的相关基因在其对低氧的耐受过程中能够发挥重要作用。     

雌二醇刺激对菲律宾蛤仔Dmrt基因表达的影响

为研究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum不同发育时期及雌二醇刺激下Dmrt基因组织表达的变化状况,在菲律宾蛤仔基因组数据中(未发表),运用BLASTe比对确定了菲律宾蛤仔的3个Dmrt基因,运用MEGA、expasy、SMART等软件进行基因结构和进化分析,根据系统发生树的聚类对3个Dmrt基因进行命名,分别为Dmrt3-like、Dmrt4-like-1、Dmrt4-like-2,并采用实时荧光定量PCR方法对Dmrt基因在菲律宾蛤仔中的时空表达及其对雌二醇处理的响应进行了研究。结果表明:菲律宾蛤仔Dmrt 3个基因的表达量从担轮幼虫到壳顶幼虫时期呈迅速增长趋势,其中Dmrt4-like-2在菲律宾蛤仔的不同发育时期均有表达;在未进行雌二醇激素处理的正常菲律宾蛤仔体内,Dmrt4-like-1和Dmrt4-like-2在鳃和外套膜中表达量最高,Dmrt3-like在鳃和内脏团中表达量较高,在外套膜和水管中不表达;短时期内(72 h)雌二醇浸泡处理使得这3个基因在菲律宾蛤仔性腺中的表达量均发生上调;长时期(60 d)雌二醇浸泡处理后,空白组的雄性性腺中3个基因的表达量皆高于雌性性腺,试验组雌雄同体性腺中的Dmrt4-like-1和Dmrt4-like-2表达量略高于雌性中的表达量(P>0.05),但显著低于雄性中的表达量(P<0.05)。研究表明,菲律宾蛤仔Dmrt基因家族参与性别分化、性腺发育过程。