斑马鱼肠道细菌的16S rDNA分子鉴定及PCR-SSCP分析

为了解斑马鱼Danio rerio肠道细菌多样性,采用细菌分离纯化、16S r DNA基因分子鉴定技术,对斑马鱼肠道细菌进行PCR-SSCP分析。结果表明:从斑马鱼肠道分离纯化出12株细菌,分别命名为Zf1、Zf2、Zf3、Zf4、Zf5、Zf6、Zf7、Zf8、Zf9、Zf10、Zf11和Zf12,其中对7株分离菌构建p MD18-T/16S r DNA的阳性克隆测序显示,Zf1、Zf11菌株与Aeromonas veronii的16S rDNA序列一致性为99%,Zf4、Zf8菌株与Sphingomonas sp.的一致性为99%,Zf5菌株与Bacillus subtilis的一致性为99%,Zf7菌株与Aeromonas sp.M10的一致性为99%,Zf10菌株与uncultured bacterium clone GI3-M-5-G01的一致性为92%;16S r DNA分子鉴定表明,Zf1、Zf7和Zf11属于气单胞菌属Aeromonas,Zf4、Zf8属于鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas,Zf5属于芽孢杆菌属Bacillus,Zf10为一种新菌株;采用PCR-SSCP技术对12株细菌16S r DNA基因V3区进行多态性分析,结果显示,斑马鱼肠道细菌16S r DNA基因V3区存在多态性,其中Zf1与Zf11菌株带型一致,Zf4与Zf8菌株带型一致。本研究结果可为揭示鱼类肠道菌群结构对其生命活动的影响提供科学参考。     

鲶源维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏特性

为探明发病怀头鲶Silurus soldatovi的病原及其生物学特征,从发病怀头鲶体内分离出1株革兰氏阴性细菌SG-1,通过细菌形态学观察、理化特性、16S r DNA测序和构建系统发育进化树分析对其进行了鉴定。结果表明:分离菌SG-1菌株葡萄糖产气、氧化酶、硝酸盐还原为阳性,鸟氨酸脱羧酶、硫化氢为阴性;进一步采用PCR方法扩增其16S r DNA序列,测序获得片段大小为1409 bp,与维氏气单胞菌Aeromonas veronii模式菌株ATCC35624序列相似性达99.86%;构建系统发育树分析显示,分离菌与维氏气单胞菌自然聚为一支,最终判定SG-1菌株为维氏气单胞菌;人工感染斑马鱼Danio rerio、鲶S.soldatovi,其死亡率均达100%,病鱼呈现体表出血、肛门红肿、腹水等症状;药敏试验结果显示,该菌对头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、诺氟沙星、左氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考等药物敏感,对阿莫西林、氨苄西林、磺胺异恶唑、甲氧嘧啶、复方新诺明等耐药。本研究结果为了解维氏气单胞菌感染鲶的致病机理及其该病的预防治疗提供了科学参考。     

鲶源维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏特性

为探明发病怀头鲶Silurus soldatovi的病原及其生物学特征,从发病怀头鲶体内分离出1株革兰氏阴性细菌SG-1,通过细菌形态学观察、理化特性、16S r DNA测序和构建系统发育进化树分析对其进行了鉴定。结果表明:分离菌SG-1菌株葡萄糖产气、氧化酶、硝酸盐还原为阳性,鸟氨酸脱羧酶、硫化氢为阴性;进一步采用PCR方法扩增其16S r DNA序列,测序获得片段大小为1409 bp,与维氏气单胞菌Aeromonas veronii模式菌株ATCC35624序列相似性达99.86%;构建系统发育树分析显示,分离菌与维氏气单胞菌自然聚为一支,最终判定SG-1菌株为维氏气单胞菌;人工感染斑马鱼Danio rerio、鲶S.soldatovi,其死亡率均达100%,病鱼呈现体表出血、肛门红肿、腹水等症状;药敏试验结果显示,该菌对头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、诺氟沙星、左氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考等药物敏感,对阿莫西林、氨苄西林、磺胺异恶唑、甲氧嘧啶、复方新诺明等耐药。本研究结果为了解维氏气单胞菌感染鲶的致病机理及其该病的预防治疗提供了科学参考。     

虹鳟致病性杀鲑气单胞菌的分离鉴定及其毒力因子的检测

为研究虹鳟Oncorhynchus mykiss致病性杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida的致病机理,利用微生物学及分子生物学方法,从患皮肤溃疡病的虹鳟病灶处分离纯化获得1株优势菌株RBWF-1,通过人工感染试验证实其具有较强的致病性。结果表明:菌株RBWF-1对虹鳟的半致死浓度(LD50)为5.5×10⁶CFU/m L;通过对菌株RBWF-1 16S r DNA基因序列扩增、测序及Blast对比,发现其与杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种Asalmonicida subsp.masoucida菌株NBRC 13748及无色亚种A.salmonicida subsp.achromogens菌株NCIMB 1110的16S rDNA基因序列同源性最高,一致性均为99.6%;构建系统发育树显示,菌株RBWF-1与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A.salmonicida subsp.salmonicida、杀日本鲑亚种、无色亚种和史氏亚种A.salmonicida subsp.smithia聚为一支;为进一步明确菌株的分类地位,利用Biolog微生物鉴定系统结合传统生理生化试验对菌株RBWF-1各项理化指标进行检测,经对比,与杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种吻合度最高,因而判断该分离株为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种;同时,对分离菌株的气溶素、溶血素、封闭带毒素、DNA酶、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶、S层蛋白7个毒力相关基因进行了PCR检测,检测结果均呈阳性;酶活性检测结果显示,菌株RBWF-1胞外产物具有蛋白酶、淀粉酶、脂酶、DNA酶和溶血活性。本研究结果可为中国虹鳟养殖过程中杀鲑气单胞菌的感染特征、分类鉴定和疫苗研制提供必要的数据和参考。     

高温大曲中高产α-淀粉酶菌株分离鉴定及其产酶性能研究

以前期实验从高温大曲中筛选得到的8株产酱香的细菌为研究对象,利用α-淀粉酶透明圈和α-淀粉酶活性测定相结合的方法从中筛选出1株高产α-淀粉酶的菌株GX05。通过形态观察及生理生化试验和16S r DNA分子生物学鉴定为假蕈状芽孢杆菌属(Bacillus pseudomycoides),并对该菌株产酶条件进行研究,最适条件为外加碳源为葡萄糖,氮源为尿素,初始p H 6,接种量13%,培养时间72 h,酶活可以达到180.12 U/g。     

16S rDNA与gyrB序列联合法鉴定一株蜡样芽孢杆菌

以从凝结芽孢杆菌活菌片中分离得到的一株YSSNJ-005菌株为目的菌株,经16S r DNA与gyr B序列联合法对其精确鉴定。研究结果表明:经过16S r DNA序列分析,初步判定菌株YSSNJ-005属芽孢杆菌属。由gyr B基因序列同源性分析及构建系统发育树对菌株YSSNJ-005继续鉴定。BLAST在线对比可知:菌株YSSNJ-005为芽孢杆菌属,且与蜡样芽孢杆菌标准菌株Bacillus cereus ATCC14579基因序列同源性达100%,可精确断定菌株YSSNJ-005是蜡样芽孢杆菌。     

翅碱蓬根系降油细菌的筛选及其生长特性研究

为建立适用于沿海滩涂石油污染的翅碱蓬-细菌复合修复技术,对翅碱蓬Suaeda heteroptera Kitag根系及其土壤进行常规细菌分离,并采用柴油为唯一碳源的平板,从中筛选具有降油性能的菌株并对筛选的菌株进行降油性能测定,研究其在不同作用时间(3、5、7 d)时对柴油的原始降解率,选择在3个时间段中降油性能均较高的菌株作为目的菌进行形态学观察、生理生化特征和16S r DNA序列分析,测定其生长特性。结果表明:试验中共分离纯化出28株细菌,其中具有降油性能的细菌有7株,编号分别为S1、G3、G4、G9、G10、G11、G12;7株细菌对柴油的原始降解率,作用3 d时分别为34.21%、3.68%、18.40%、18.95%、0.52%、9.47%、21.05%,作用5 d时分别为44.06%、3.19%、23.90%、24.70%、31.47%、25.90%、46.22%,作用7 d时分别为41.09%、1.49%、14.36%、28.22%、14.36%、29.70%、31.68%;S1、G11和G12菌株对柴油具有较高降解率;S1属微杆菌属Microbacterium,与Microbacterium saperdate的相似性为98.7%,G11和G12均属于刘志恒菌属Zhihengliuella,与Zhihengliuella halotolerans的相似性均为99.8%,3株菌的最适生长温度范围均为15³0℃,最适生长盐度分别为0、20、20,最适生长p H分别为5、7和7。     

翅碱蓬根系降油细菌的筛选及其生长特性研究

为建立适用于沿海滩涂石油污染的翅碱蓬-细菌复合修复技术,对翅碱蓬Suaeda heteroptera Kitag根系及其土壤进行常规细菌分离,并采用柴油为唯一碳源的平板,从中筛选具有降油性能的菌株并对筛选的菌株进行降油性能测定,研究其在不同作用时间(3、5、7 d)时对柴油的原始降解率,选择在3个时间段中降油性能均较高的菌株作为目的菌进行形态学观察、生理生化特征和16S r DNA序列分析,测定其生长特性。结果表明:试验中共分离纯化出28株细菌,其中具有降油性能的细菌有7株,编号分别为S1、G3、G4、G9、G10、G11、G12;7株细菌对柴油的原始降解率,作用3 d时分别为34.21%、3.68%、18.40%、18.95%、0.52%、9.47%、21.05%,作用5 d时分别为44.06%、3.19%、23.90%、24.70%、31.47%、25.90%、46.22%,作用7 d时分别为41.09%、1.49%、14.36%、28.22%、14.36%、29.70%、31.68%;S1、G11和G12菌株对柴油具有较高降解率;S1属微杆菌属Microbacterium,与Microbacterium saperdate的相似性为98.7%,G11和G12均属于刘志恒菌属Zhihengliuella,与Zhihengliuella halotolerans的相似性均为99.8%,3株菌的最适生长温度范围均为15~30℃,最适生长盐度分别为0、20、20,最适生长p H分别为5、7和7。     

养殖大菱鲆感染嗜水气单胞菌的分离、毒力分析及ERIC-PCR分型

为对辽宁省葫芦岛市养殖患病大菱鲆Scophthalmus maximus(L.)全年感染嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila情况进行调查,通过细菌16S rRNA基因序列分析,以及嗜水气单胞菌特异性引物和气溶素基因的双重PCR扩增对分离株进行鉴定。结果表明:调查中共分离到7株嗜水气单胞菌(AP40301、AP40401、AP40402、AP40403、AP40501、AP40502和AP40503),且均含有气溶素基因(aer A);ERIC-PCR结果进一步显示,7株嗜水气单胞菌存在独立基因型,分别标记为Ⅰ和Ⅱ型,其中Ⅰ型分离株中有3株来自绥中,1株来自兴城,Ⅱ型分离株3株均来自兴城;人工感染试验显示,7株嗜水气单胞菌均具有强致病性,致病率为100%。本研究结果可为养殖大菱鲆的临床诊断以及疾病防控提供理论依据。     

一株抗肿瘤活性的红树林细菌的筛选及鉴定

从深圳红树林土壤中分离出一株嗜盐细菌S17,对其进行生理生化特性研究并进行潜在的抗菌和抗肿瘤活性评价,采用16S rDNA序列分析及系统发育分析方法对其进行分子鉴定。研究结果表明:菌株S17为中度嗜盐细菌,与短小芽孢杆菌属Bacillus pumilus ATCC 7061具有99%同源性。S17的粗提物对多种细菌和肿瘤细胞的生长都具有较强的抑制作用,可以进行进一步的开发和利用。