仿刺参体腔细胞原代培养方法初探

以仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞为材料,分别用体腔液和MEM、L-15两种培养基进行原代培养,初步探讨了仿刺参体腔细胞培养的基本条件。结果表明:在18℃下封闭培养,体腔细胞在体腔液中直接培养能够贴壁、伸展,细胞呈球形和上皮样,但凝集现象严重;在合成培养基(MEM、L-15)中,体腔细胞凝集明显减少;与MEM培养基相比,体腔细胞在L-15培养基中贴壁时间长,伸展状态好,上皮样细胞较多,可培养至72 h;培养基中血清的添加量与细胞的培养状态和可培养时间关系不明显。     

双斑东方鲀海盘虫病病原鉴定和鳃组织病理观察

海盘虫Haliotrema sp.病是双斑东方鲀Takifugu bimaculatus养殖生产上主要致死性病害之一，为深入了解该病，本研究中从2016年6月—2019年6月对池塘养殖的双斑东方鲀海盘虫病发病情况进行调查，利用形态学观察、几丁质结构特征分析和分子生物学技术对病原虫体进行鉴定与分析，并观察病鱼鳃组织病理变化。结果表明：该病春末夏初和秋季易发，发病时病鱼主要症状为缓游于水面，食欲减退或不摄食；体色苍白，体形消瘦，尾鳍、臀鳍缺损，鳃丝上有大量海盘虫虫体，鳃片黏液多，肝脏、脾脏充血；病原虫体经形态学观察和几丁质结构特征分析，鉴定为双裂海盘虫H.bilobatus,双斑东方鲀为其宿主新记录；对该虫体18S rDNA和28S rDNA(C1～D2区)基因片段扩增测序分析显示，其18S rDNA序列(1 282 bp)与栉齿刺尾鲷海盘虫H.ctenochaeti、丝蝴蝶鱼海盘虫H.aurigae等序列相似，一致性达97.68%～98.30%,其28S rDNA序列(886 bp)(C1～D2区)与镰茎海盘虫H.sicklocirrus序列最相似，但一致性仅达90.28%;基于18S rDNA和28S rDNA序列构建的系统发育树均显示，双裂海盘虫单为独立分支，为NCBI基因数据库未登记海盘虫属虫种；鳃组织病理学观察发现，虫体寄生导致双斑东方鲀鳃丝机械损伤、鳃上皮组织增生或脱落，甚至引起鳃组织病变、出血，重度感染会引发鳃小片坏死、崩解，大量黏液浸润鳃丝，从而使病鱼呼吸困难而死亡。研究表明，双裂海盘虫为福建池塘养殖双斑东方鲀海盘虫病的感染病原，该病春末夏初和秋季易流行。     

刺参机体酵母菌组成及其拮抗活性的研究

采用PDA、YPD、MEA培养基从刺参Apostichopus japonicus的体表、肠道和呼吸树分离出23株酵母菌,使用玻璃珠破碎方法提取其DNA,然后用酵母菌通用引物NL-1/NL-4从DNA中成功扩增出26S rDNA片段,将PCR产物进行测序,将各菌株序列在GenBank数据库中进行检索,从Blast比对结果中取相似性最高的序列,用Mega 4.0软件对所有序列进行聚类分析,采用邻接法构建系统发育树。结果表明:从大连柏岚子海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、梅奇酵母属和丝孢酵母属,从大连市黑石礁海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、假丝酵母属、德巴利氏酵母属、有孢汉逊酵母属和毕赤酵母属;以8株刺参病原菌作为指示菌,采用双层琼脂扩散法对分离菌株的拮抗活性进行测定,获得拮抗酵母菌17株,占总测试菌株的73.9%,从刺参机体的体表、肠道和呼吸树可以筛选出不同得率的活性菌株,其抗菌谱和活性强度各不相同,其中C11菌株的抗菌谱最广,抗菌活性最强;从肠道分离出的拮抗菌C11、C14和C21菌株的胞外产物经硫酸铵沉淀后也具有抗菌活性,C14菌株胞外产物经65%硫酸铵沉淀获得的粗提物对热和蛋白酶K敏感,表明其拮抗物质为蛋白质。     

盾构盾尾强度计算分析

盾尾是盾壳中最薄弱的部分,盾构施工时其承受较大的地层土压力、水压力和自重荷载,因此对盾尾强度和变形的分析是盾构设计的重要组成部分.根据盾尾的受力状况,建立盾尾的荷载模型,然后通过结构力学中的假定抗力法对盾尾进行力学分析,将盾尾简化为等截面圆环形梁结构,建立盾尾受力分析的简化力学模型,并导出盾尾内力的计算公式.以上海地铁工程R413线地质条件和盾构参数为基础对盾尾的受力和强度进行验算.该研究提供盾尾强度计算的解析方法,简单直观、概念清楚,实例计算显示各分项荷载对盾尾内力的不同影响.     

养殖大菱鲆红斑溃疡病病原菌的生物学特性研究

为研究养殖大菱鲆Scophthalmus maximus红斑溃疡病病原菌的生物学特性,从辽宁葫芦岛地区养殖大菱鲆患病鱼的溃疡灶、肝脏、肾脏和脾脏中均分离到一株优势菌,命名为HLD01,该菌株呈乳白色,圆形,直径为(0.6±0.1)mm,表面湿润、光滑;用腹腔注射法和划伤浸泡法进行人工感染试验,这两种方法感染大菱鲆的半致死剂量分别为8.4×10~7、6.3×10~4CFU/mL,结果显示,人工感染患病大菱鲆体表出现与自然发病大菱鲆相同的溃疡灶及其他病症,表明菌株HLD01对大菱鲆有较强的致病力,可以引起养殖大菱鲆发生红斑溃疡病;生理生化鉴定结果显示,该菌与杀鲑气单胞菌无色亚种Aeromonas salmonicidasubsp.achromogenes相似度最高;基于16S rDNA序列构建的系统进化树结果显示,该菌与气单胞菌属Aeromonas细菌聚为一支。综合HLD01菌株各项生物学特征,将其鉴定为杀鲑气单胞菌无色亚种,该菌对庆大霉素、卡那霉素、菌必治、恩诺沙星等药物高度敏感,可参考选取以上药物来治疗和控制养殖大菱鲆溃疡病。     

养殖大菱鲆红斑溃疡病病原菌的生物学特性研究

为研究养殖大菱鲆Scophthalmus maximus红斑溃疡病病原菌的生物学特性,从辽宁葫芦岛地区养殖大菱鲆患病鱼的溃疡灶、肝脏、肾脏和脾脏中均分离到一株优势菌,命名为HLD01,该菌株呈乳白色,圆形,直径为(0.6±0.1)mm,表面湿润、光滑;用腹腔注射法和划伤浸泡法进行人工感染试验,这两种方法感染大菱鲆的半致死剂量分别为8.4×10⁷、6.3×107、6.3×10⁴CFU/mL,结果显示,人工感染患病大菱鲆体表出现与自然发病大菱鲆相同的溃疡灶及其他病症,表明菌株HLD01对大菱鲆有较强的致病力,可以引起养殖大菱鲆发生红斑溃疡病;生理生化鉴定结果显示,该菌与杀鲑气单胞菌无色亚种Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes相似度最高;基于16S rDNA序列构建的系统进化树结果显示,该菌与气单胞菌属Aeromonas细菌聚为一支。综合HLD01菌株各项生物学特征,将其鉴定为杀鲑气单胞菌无色亚种,该菌对庆大霉素、卡那霉素、菌必治、恩诺沙星等药物高度敏感,可参考选取以上药物来治疗和控制养殖大菱鲆溃疡病。     

芽孢杆菌L15菌株发酵培养条件的优化

芽孢杆菌L15菌株能有效降低刺参Apostichopus japonicas养殖水中的化学耗氧量(COD)和氨氮(NH+4-N)含量,促进刺参生长,为大量发酵培养L15菌株并降低培养成本,以豆粕、麦麸、玉米酒糟、棉籽粕为碳、氮源,对发酵培养L15菌株的最佳碳、氮源及其配比和最佳发酵条件(如装液量、接种量、转速等)进行了初步优化研究。结果表明:培养芽胞杆菌L15菌株的最佳碳、氮源为麦麸和豆粕,最佳添加量分别为3、2 g/L;最佳发酵培养条件为装液量1/3、接种量1%、转速160 r/min;在最佳培养基和最适培养条件下,发酵培养的L15菌株细菌数量可达1011cfu/m L,与用2216E培养基培养的L15菌株相比,在实验室条件下,对海参底泥COD的去除率虽无明显变化,但培养成本却降低了91%。研究表明,用豆泊和麦麸作为培养基培养L15菌株具有可行性,不仅细菌数量达标,且培养成本显著降低。     

芽孢杆菌L15菌株发酵培养条件的优化

芽孢杆菌L15菌株能有效降低刺参Apostichopus japonicas养殖水中的化学耗氧量(COD)和氨氮(NH+4-N)含量,促进刺参生长,为大量发酵培养L15菌株并降低培养成本,以豆粕、麦麸、玉米酒糟、棉籽粕为碳、氮源,对发酵培养L15菌株的最佳碳、氮源及其配比和最佳发酵条件(如装液量、接种量、转速等)进行了初步优化研究。结果表明:培养芽胞杆菌L15菌株的最佳碳、氮源为麦麸和豆粕,最佳添加量分别为3、2 g/L;最佳发酵培养条件为装液量1/3、接种量1%、转速160 r/min;在最佳培养基和最适培养条件下,发酵培养的L15菌株细菌数量可达1011cfu/m L,与用2216E培养基培养的L15菌株相比,在实验室条件下,对海参底泥COD的去除率虽无明显变化,但培养成本却降低了91%。研究表明,用豆泊和麦麸作为培养基培养L15菌株具有可行性,不仅细菌数量达标,且培养成本显著降低。     

红鳍东方鲀鳍细胞系的建立及生长特性研究

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes鳍细胞系对该鱼病毒病诊断和治疗的影响,采用组织块培养法启动红鳍东方鲀鳍组织细胞的原代培养,用胰蛋白酶消化法进行传代培养,目前红鳍东方鲀鳍细胞传至40代,为成纤维细胞样细胞,原代培养和早期传代培养使用的培养基为添加了20%胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基,添加的生长因子分别为终浓度为10 ng/m L的人碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、终浓度为20 ng/m L的Ⅰ型胰岛素样生长因子和终浓度为20μg/m L的硫酸软骨素,30代以后使用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基,将细胞于25℃、5%CO2恒温培养箱中培养。结果表明:生长曲线显示,细胞在0～2d内处于潜伏期,2～4 d时进入对数期,4～5 d时进入平台期,5 d后开始转入衰退期;红鳍东方鲀鳍细胞系的倍增时间为50. 24 h;细胞经超低温保存60 d,解冻复苏后测定其存活率为80%;经微卫星位点扩增,凝胶电泳后的条带证实细胞系来源于红鳍东方鲀。研究表明,红鳍东方鲀鳍细胞系的建立丰富了鱼类细胞系的种类,也为红鳍东方鲀病毒病的研究及疫苗制备等提供了数据资料。     

消油剂对红鳍东方鲀幼鱼的急性毒性效应

在水温为(21.0±0.5)℃、盐度为32的条件下,研究了消油剂和原油-消油剂混合液对红鳍东方鲀Takifugu rubripes幼鱼(体质量为2.73 g±0.66 g)的急性毒性效应。结果表明:在96 h之内,随试验时间(t)的延长,消油剂对红鳍东方鲀的半致死浓度(LC50)逐渐降低,二者呈幂函数关系,其关系式为LC50=9452.2t-0.9529(R2=0.8794);原油-消油剂混合液对红鳍东方鲀的LC50也随试验时间的延长逐渐降低,二者呈线性函数关系,其关系式为LC50=-0.0303t+11.244(R2=0.891);消油剂和原油-消油剂混合液对红鳍东方鲀的96 h LC50分别为146.41、8.45 mg/L,表明原油-消油剂混合液对红鳍东方鲀的生物毒性大于消油剂,消油剂对红鳍东方鲀的生物毒性为一般毒性,而原油-消油剂混合液为高毒性;红鳍东方鲀中毒症状表现为在水面缓慢游动,有时失去平衡,身体侧翻,最后沉卧于水底死亡;死亡的红鳍东方鲀表现为鳃丝充血肿胀,鳃和体表的黏液分泌增加,体表腐烂发白。