仿刺参体壁的组织学和组织化学

用组织学和组织化学方法对仿刺参Apostichopus japonicus体壁的结构和成分进行了研究。组织学研究结果表明:仿刺参体壁自外向内由上皮层、结缔组织层、肌肉层和体腔上皮层组成。上皮层主要包括一层薄的角质层和2³层上皮细胞,结缔组织层内含丰富的胶原纤维,肌肉层主要是平滑肌,体腔上皮层由单层扁平上皮组成。组织化学研究结果表明:仿刺参体壁各层(除体腔上皮层外)均富含糖类和蛋白质,不含脂类;碱性磷酸酶和酸性磷酸酶在体壁中存在酶活性的部位相同,主要在结缔组织层的空洞状结构处以及结缔组织层与肌肉层交联处。     

双齿围沙蚕主要器官组织学的研究

采用组织切片法对双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis的组织结构进行了系统观察。结果表明,双齿围沙蚕主要由体壁、疣足、消化系统和排泄系统组成。体壁从内向外分为壁体腔膜、肌肉层、表皮层和角质层,壁体腔膜是一层扁平细胞,肌肉层由环行、纵行和斜行的平滑肌组成,表皮层为单层柱状细胞,其中夹有腺细胞和感觉细胞;疣足的壁与体壁一致,疣足内充满毛细血管、间充质细胞、黏液细胞和血细胞,在性腺发育期间,有大量生殖细胞着生于疣足壁上;消化系统包括消化管和消化腺两部分,消化管为从口到肛门的直管,包括口、口腔、咽、食道、胃和肠,在食道两侧有一对食道腺;排泄系统由肾管构成。     

仿刺参体壁再生形态学和组织学的研究

用手术刀片切掉仿刺参体壁表皮层和结缔组织层,深度至体腔膜。术后将仿刺参放入正常海水中饲养,用肉眼和光学显微镜观察仿刺参体壁再生的外部形态和组织学变化,并通过免疫荧光方法检测小鼠抗人角蛋白19(CK19)的表达。形态学观察表明:术后1 d,伤口呈凹陷状,体腔膜上增生出一薄层乳白色结缔组织;术后7 d伤口表面出现色素;术后11 d凹陷基本变平;术后21 d,伤口处体壁形态与颜色恢复至术前。组织学观察表明:术后1 d,疏松结缔组织直接暴露,创伤面附近有成纤维细胞和胶原纤维聚集;术后3 d,结缔组织外层有上皮细胞聚集;术后4 d,结缔组织间可见一条带状间隙;术后7 d,表皮外层出现角质层;术后11 d,上皮层厚度接近正常组织,但结缔组织较松散;术后21 d,上皮细胞数量、排列以及结缔组织的排列同正常组织。免疫荧光检测结果表明:CK19在正常的仿刺参体壁中表达得比较分散;术后3 d,CK19在创伤面附近集中表达。     

仿刺参不同组织液的抗菌活性

采用平板菌落计数法测定仿刺参Apostichopus japonicus体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液和体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌Vibrio harveyi的抑制作用,并对健康仿刺参与感染后仿刺参的体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用进行了比较;采用乙醇沉淀、离心等方法从仿刺参体壁内皮组织中粗提得到一种水溶性成分,测定了该成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌Staphylococcus albus和迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda的抑菌活性,并初步研究了该成分的基本性质。结果表明:仿刺参体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌的抑制效果显著,体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液对哈氏弧菌的抑制效果不显著;感染状态下,仿刺参体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用与健康状态相比有所降低。提取的水溶性成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌和迟钝爱德华氏菌均有明显的抑制作用;该成分的茚三酮反应呈阳性,其中蛋白质的质量分数为17.48%;该成分经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到5个蛋白条带,相对分子质量大约为55 300、46 100、34 700、19 500和14 500,初步认为其含有肽类抗菌活性物质。     

刺参体腔细胞表面抗原分类及体壁组织中免疫细胞的研究

为检测刺参Apostichopus japonicus体腔细胞表面抗原的分类,确定其体壁组织中免疫细胞的定位,选取体质量为(160±10)g的健康刺参,采用流式细胞术(Flow cytometry, FCM)技术对刺参体腔细胞表面抗原CD类似物类型(CD3、CD4、CD7、CD8、CD11b、CD14、CD38)进行了检测,并使用免疫组化法对刺参体壁组织中的免疫细胞进行初步定位研究。结果表明:直径大于和小于5μm的体腔细胞,表面抗原CD7和CD14类似物均呈阳性,刺参体壁结缔组织经CD7、CD14类似物免疫组化染色后,可见分布在结缔组织细胞间隙中褐色阳性细胞,认为该两种表面抗原呈阳性。研究表明,在刺参体腔和体壁细胞中均能检测到CD7及CD14类似物,提示CD7和CD14类似物在免疫机能上具有T细胞和NK细胞的免疫学功能。     

刺参体腔细胞表面抗原分类及体壁组织中免疫细胞的研究

为检测刺参Apostichopus japonicus体腔细胞表面抗原的分类,确定其体壁组织中免疫细胞的定位,选取体质量为(160±10)g的健康刺参,采用流式细胞术(Flow cytometry, FCM)技术对刺参体腔细胞表面抗原CD类似物类型(CD3、CD4、CD7、CD8、CD11b、CD14、CD38)进行了检测,并使用免疫组化法对刺参体壁组织中的免疫细胞进行初步定位研究。结果表明:直径大于和小于5μm的体腔细胞,表面抗原CD7和CD14类似物均呈阳性,刺参体壁结缔组织经CD7、CD14类似物免疫组化染色后,可见分布在结缔组织细胞间隙中褐色阳性细胞,认为该两种表面抗原呈阳性。研究表明,在刺参体腔和体壁细胞中均能检测到CD7及CD14类似物,提示CD7和CD14类似物在免疫机能上具有T细胞和NK细胞的免疫学功能。     

复方中草药对仿刺参免疫力和抗病力的影响

将以黄芪、党参为主药并加入另外5味中草药所配伍的复方中草药粉碎制剂,以质量分数分别为0%(对照组)、0.5%、1.5%和2.5%的剂量添加于基础饲料中,连续投喂仿刺参Apostichopus japonicus37d,在试验开始后第1、2、3、4周采样,测定仿刺参的肠、触手、体壁、肌肉和体腔液中的抗菌活力及体腔细胞的吞噬活性;于试验开始后第4周,用仿刺参"化皮病"病原菌黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi以3.7×108个/mL的浓度在每头仿刺参背部注射0.1 mL的菌悬液,每天观察记录死亡个体症状,统计死亡率,计算相对保护率(共观察记录7 d)。结果显示:各组的抗菌活力均随着用药时间的延长、用药浓度的加大而升高,总体趋势表现为2.5%添加组>1.5%添加组>0.5%添加组>对照组;各用药组仿刺参的体腔细胞吞噬能力均随着用药时间的延长呈现先升高后降低的趋势,第2、3周达峰值,总体趋势表现为1.5%添加组>2.5%添加组>0.5%添加组>对照组;攻毒试验结果显示,对照组仿刺参3 d后全部死亡,第7天各用药组相对保护率依次为1.5%添加组>0.5%添加组>2.5%添加组,分别为30.0%、20.0%和10.0%。由此表明,该复方中草药可以显著提高仿刺参的免疫力和抗病力,以1.5%添加剂量组的效果最佳。     

仿刺参消化道的再生形态学与组织学

通过解剖和组织切片观察仿刺参Apostichopus japonicus消化道再生的外部形态和组织学变化过程。再生过程可分为4个阶段:原基形成阶段,食道和胃伸长,出现去分化现象,肠系膜游离端边缘增厚;肠腔形成阶段,食道和胃仍处于去分化状态,胃和泄殖腔两端沿增厚的肠系膜相向形成肠腔,组织分为肠腔上皮层、结缔组织层和体腔上皮层;分化阶段,消化道逐渐具备功能,食道和胃的组织结构开始重建,消化道黏膜上皮由多层立方细胞逐渐分化为单层柱状细胞,肌肉层逐渐形成;生长阶段,组织结构恢复正常,变化仅表现在生长上。     

仿刺参体腔细胞原代培养方法初探

以仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞为材料,分别用体腔液和MEM、L-15两种培养基进行原代培养,初步探讨了仿刺参体腔细胞培养的基本条件。结果表明:在18℃下封闭培养,体腔细胞在体腔液中直接培养能够贴壁、伸展,细胞呈球形和上皮样,但凝集现象严重;在合成培养基(MEM、L-15)中,体腔细胞凝集明显减少;与MEM培养基相比,体腔细胞在L-15培养基中贴壁时间长,伸展状态好,上皮样细胞较多,可培养至72 h;培养基中血清的添加量与细胞的培养状态和可培养时间关系不明显。     

低盐胁迫下仿刺参DD104基因的定量表达分析

以2龄仿刺参Apostichopus japonicus为试验材料,利用实时定量PCR技术分析了DD104基因在仿刺参不同组织中以及低盐胁迫后不同时间的表达情况。结果表明:DD104基因在仿刺参管足中的表达水平最高,在体腔液、触手、呼吸树中的表达水平次之,在体壁、肌肉和肠中的表达水平较低;仿刺参在受到低盐胁迫后,体内DD104 mRNA的表达随盐度胁迫时间的增加呈现波动性增减,胁迫72 h时DD104基因的表达最强,在肌肉和管足中的表达量达到最大;胁迫48 h时肠组织中的表达量最大;胁迫24 h时体腔液中的表达量最大。研究表明,低盐胁迫后DD104基因在仿刺参不同组织中的表达发生变化的时间点不同,低盐胁迫下DD104基因表达量的变化规律说明该基因的表达可能与渗透胁迫密切相关。