金乌贼微卫星标记开发及两个野生群体遗传多样性比较

为进一步了解金乌贼Sepia esculenta野生群体遗传多样性水平,采用磁珠富集法从金乌贼基因组中开发了微卫星标记,并应用青岛(QD)金乌贼野生群体对其多态性进行评价,进而比较了青岛和长江口(CJK)两个野生群体的遗传差异。结果表明:开发标记的种群遗传学评价显示,在269个克隆子中,有192个含有微卫星序列(71.38%),基于该序列设计85对引物,其中20对通过筛选,完美型占60%,非完美型占10%,复合型占30%;经群体验证,表观等位基因数(A)为2～17不等,平均为8.15,观测杂合度(H_O)分布范围为0.146～0.936,平均为0.630,期望杂合度(H_E)分布范围为0.172～0.930,平均为0.702;其中5个位点不符合哈迪—温伯格(Hardy-Weinberg)平衡预期,存在零等位基因可能是其偏离平衡的原因;应用本研究开发的引物对2个近源种扩增,开发的20个标记位点中有6个在针乌贼Sepia andreana中表现为多态,4个位点在曼氏无针乌贼Sepiella maindroni中表现为多态;应用开发的11个位点对青岛和长江口两个野生群体进行遗传差异分析显示,所有位点中,青岛群体共检测到163个等位基因,长江口群体共检测到152个等位基因,每个位点的等位基因数为5～28和6～26不等,平均等位基因数分别为14.818和13.818;青岛群体独有等位基因19个,观测杂合度分布范围为0.250～0.936,平均为0.731,期望杂合度分布范围为0.265～0.930,平均为0.771,多态信息含量为0.223～0.946,平均为0.746;长江口群体独有等位基因8个,观测杂合度分布范围为0.500～0.896,平均为0.731,期望杂合度分布范围为0.623～0.960,平均为0.857,多态信息含量为0.614～0.948,平均为0.845;群体间遗传分化较弱(F_(st)值为0.032 5),群体分配分析结果表明,两个种群中所有个体正确分配到各自种群的概率分别为86.4%和84.0%。研究表明,本试验中开发的微卫星标记位点多样性水平略低于前人的研究,但有一定的跨种扩增通用性,长江口群体多样性水平略高于青岛群体,尽管两个群体间遗传分化程度不高,但存在明显差异。     

金乌贼微卫星标记开发及两个野生群体遗传多样性比较

为进一步了解金乌贼Sepia esculenta野生群体遗传多样性水平,采用磁珠富集法从金乌贼基因组中开发了微卫星标记,并应用青岛(QD)金乌贼野生群体对其多态性进行评价,进而比较了青岛和长江口(CJK)两个野生群体的遗传差异。结果表明:开发标记的种群遗传学评价显示,在269个克隆子中,有192个含有微卫星序列(71.38%),基于该序列设计85对引物,其中20对通过筛选,完美型占60%,非完美型占10%,复合型占30%;经群体验证,表观等位基因数(A)为2～17不等,平均为8.15,观测杂合度(H_O)分布范围为0.146～0.936,平均为0.630,期望杂合度(H_E)分布范围为0.172～0.930,平均为0.702;其中5个位点不符合哈迪—温伯格(Hardy-Weinberg)平衡预期,存在零等位基因可能是其偏离平衡的原因;应用本研究开发的引物对2个近源种扩增,开发的20个标记位点中有6个在针乌贼Sepia andreana中表现为多态,4个位点在曼氏无针乌贼Sepiella maindroni中表现为多态;应用开发的11个位点对青岛和长江口两个野生群体进行遗传差异分析显示,所有位点中,青岛群体共检测到163个等位基因,长江口群体共检测到152个等位基因,每个位点的等位基因数为5～28和6～26不等,平均等位基因数分别为14.818和13.818;青岛群体独有等位基因19个,观测杂合度分布范围为0.250～0.936,平均为0.731,期望杂合度分布范围为0.265～0.930,平均为0.771,多态信息含量为0.223～0.946,平均为0.746;长江口群体独有等位基因8个,观测杂合度分布范围为0.500～0.896,平均为0.731,期望杂合度分布范围为0.623～0.960,平均为0.857,多态信息含量为0.614～0.948,平均为0.845;群体间遗传分化较弱(F_(st)值为0.032 5),群体分配分析结果表明,两个种群中所有个体正确分配到各自种群的概率分别为86.4%和84.0%。研究表明,本试验中开发的微卫星标记位点多样性水平略低于前人的研究,但有一定的跨种扩增通用性,长江口群体多样性水平略高于青岛群体,尽管两个群体间遗传分化程度不高,但存在明显差异。     

松江鲈群体遗传多样性的AFLP分析

利用AFLP分子标记技术对辽宁鸭绿江水域丹东段和河北秦皇岛渤海海域两个松江鲈Trachidermus fasciatus群体的遗传多样性进行分析研究。结果表明:用6对选择性引物,从两个群体的63个个体共扩增出360个位点,多态位点214个;松江鲈丹东和秦皇岛两群体的多态位点比率为50.28%、50.00%,平均杂合度和Shannon s指数分别为0.1690、0.1733和0.2534、0.2592,说明两个群体遗传多样性在同一水平上;Shannon s指数和AMOVA分析均显示松江鲈的遗传变异主要来自于群体内个体间,而群体间无明显的遗传分化;松江鲈UPGMA系统树没有依据群体分别聚类,未出现明显分支,无明显遗传差异;群体的显性基因型频率分布显示两个群体的遗传结构相似。     

中华鳖微卫星座位的分离与鉴定

将生物素杂交法与放射性同位素杂交法相结合,从中华鳖Trionyx sinensis基因组中分离出含有GA/CT和CA/GT重复类型的微卫星分子标记。共获得931个阳性克隆,从中选取286个进行测序,得到273个(95.45%)含有微卫星的序列,其中70.34%的重复数在10以上,55.51%为完美型。除探针中使用的CA和GA重复单元外,还观察到GC、TGTGT的重复序列。设计获得242对微卫星引物,合成40对,并对中华鳖群体遗传背景进行分析,结果表明:8对引物表现为单态,6对引物扩增带不是目的带,4对引物无扩增条带,其余22对引物扩增出多态性条带;平均等位基因数为3.48个,观测杂合度为0.1667⁰.9620,期望杂合度为0.15280.9620,期望杂合度为0.1528⁰.7222,多态信息含量为0.14110.7222,多态信息含量为0.1411⁰.6800,平均多态信息含量为0.4382,大部分标记适用于中华鳖群体的遗传研究。     

人工养殖鲶的TRAP遗传分析

建立了鲶Silurus asotus的TRAP-PCR反应体系,采用24个TRAP引物组合对鲶人工选育群体进行引物适用性的研究,将获得的多态性位点用于研究鲶群体的遗传结构。结果表明:有9个引物组合可产生有效位点,其中多态引物占所筛选引物总数的37.5%,平均每条引物扩增出15个位点。共扩增出135个位点,多态位点数为75,多态位点比例为55.56%。说明TRAP标记技术适用于鲶的遗传多样性研究,可以作为构建鲶遗传连锁图谱的分子标记。     

利用164个微卫星标记分析镜鲤家系的遗传多样性和经济性状

利用来源于细菌人工染色体文库(Bacterial artificial chromosome,BAC)的164个微卫星标记分析了镜鲤Cyprinus carpio L.家系遗传多样性及标记与体质量、体长、体高、体厚4个性状间的相关性。结果表明:镜鲤家系68个个体在164个微卫星位点上共扩增出402条条带,观察杂合度(Ho)为0.220 6～1.000 0,平均为0.62,多态性信息含量(PIC)为0.243 9～0.702 8,平均为0.42,总体表现为中度多态(0.25≤PIC≤0.50),遗传多样性水平较高;利用SPSS 17.0的GLM模块分析标记与性状间的相关性,有25个标记与相应性状相关(P<0.05),其中6个标记与性状的相关性达到极显著水平(P<0.01),使用独立样本T检验和Duncan's多重比较找到了每个位点的优势基因型;利用NCBI的Blast模块将各位点序列与斑马鱼的序列进行比对,有11个位点与斑马鱼基因相关,一致度均在80%以上,其中6个基因功能已知。     

“光合1号”中华绒螯蟹微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选

采用磁珠富集法(Fast isolation by AFLP sequences containing repeats,FIASCO)构建"光合1号"新品种中华绒螯蟹Eriocheir sinensis基因组微卫星文库。用PCR法对225个单菌落进行鉴定,共获得168个阳性克隆,测序发现有94个含有微卫星座位,其准确率为55.95%,其中单元重复次数为5～10的序列占34.04%,重复次数为10～20的序列占20.21%,重复次数大于20的序列占45.75%,重复次数最高达到92次;完美型微卫星座位69个(占73.40%),非完美型微卫星座位17个(占18.09%),混合型微卫星座位8个(占8.51%);根据微卫星侧翼序列设计并合成53对引物,检测结果显示,有31对(占58.50%)引物能够扩增出特异性条带;选择其中14对多态性良好的引物用于中华绒螯蟹辽河野生群体的遗传多样性分析,共检测到148个等位基因,单个位点等位基因数为7～13个,平均为10.6个,观测杂合度为0.214 3～0.666 7,期望杂合度为0.825 4～0.910 1,多态性信息含量为0.766 3～0.865 4。     

6个建鲤家系的遗传结构及不同亲缘关系个体间的遗传差异分析

选用12个微卫星位点对6个建鲤Cyprinus carpio var.jian家系的遗传结构和不同亲缘关系个体间的遗传差异进行分析。结果表明:12个位点在6个建鲤家系中共检测出80个等位基因和172种基因型,平均每个位点检测到等位基因6.7个和基因型14.3种;各家系平均观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.725～0.883和0.533～0.656;平均多态信息含量(PIC)为0.440～0.584;固定系数(FIS)计算结果表明,6个建鲤家系都表现为杂合子过剩(FIS<0);6个建鲤家系遗传分化系数(Fst)值为0.209 4,家系间平均遗传距离为0.458 7;6个家系中的父子间、母子间和同胞子代间的平均遗传距离分别为0.333 1、0.347 7和0.318 0,没有血缘关系个体间的平均遗传距离为0.635 3,且极显著大于亲子之间和同胞子代之间的遗传距离(P<0.01)。本研究表明,6个建鲤家系的多态信息含量丰富,遗传多样性水平较高,具有较大的选育潜力。     

基于微卫星标记的刺参群体遗传结构分析及与经济性状的相关性研究

采用微卫星分子标记技术对7个刺参Apostichopus japonicus(Selenka)群体:辽宁葫芦岛养殖群体、山东烟台野生群体、山东莱州养殖群体、大连旅顺底播群体、丹东东港养殖群体、大连广鹿岛底播群体、大连黑石礁野生群体的遗传多样性进行分析,并随机抽取7个群体中的180头刺参进行体长、体宽、体积、体质量和总棘数与17个微卫星标记之间的相关性研究。结果表明:用12个微卫星标记共扩增获得83个等位基因,每个位点的等位基因数为3～12个,长度为102～368 bp。刺参群体位点多样性分析显示,各刺参群体等位基因数为5.083 3～5.416 7,平均值为5.261 9;有效等位基因数为3.205 0～3.701 1,平均值为3.446 8;观测杂合度为0.547 5～0.686 9,平均值为0.614 9;期望杂合度为0.649 1～0.697 1,平均值为0.674 1;多态性信息含量为0.598 9～0.638 6,平均值为0.620 0。对各群体的Hardy-Weinber平衡检测显示,7个刺参群体均存在不同程度的平衡偏离。刺参群体遗传分化与基因流分析显示,刺参群体间遗传分化系数平均值为0.078 2,变异主要来源于群体内;基因流平均值为5.301 9,刺参群体间存在一定程度的基因交流。刺参群体间遗传相似性系数为0.731 8～0.886 0,UPGMA聚类显示,7个群体中山东烟台野生群体单独为一类,其他6个群体聚为一类。刺参微卫星标记与经济性状相关性分析显示,HC312、EAJ07位点与刺参体长、体积、体质量显著相关(P<0.05);IS45、EAJ03、EAJ04位点与刺参体长、体积、体宽、体质显著相关(P<0.05);SJ04位点仅与刺参总棘数显著相关(P<0.05);SJ09位点与刺参体积、体宽、体质量显著相关(P<0.05);SJ18位点仅与刺参体宽显著相关(P<0.05);SJ19位点与刺参体积、体宽、体质量、总棘数显著相关(P<0.05);SP072位点与刺参体积、体质量显著相关(P<0.05)。本研究结果可为刺参群体结构优化、经济性状的QTL定位、养殖和选育提供参考。     

利用微卫星标记指导红鳍东方鲀亲本选配

为制定红鳍东方鲀家系配组方案提供可行性指导,利用微卫星标记辅助红鳍东方鲀Takifugu rubripes家系的建立,选择34个微卫星标记对红鳍东方鲀两个群体进行遗传评估。结果表明:A群体的平均等位基因数(Na)和Nei基因多样性指数(He)分别为6.647 0和0.711 5,B群体的相应值分别为4.647 1和0.646 1,且两个群体之间的遗传差异达到显著性水平(P<0.05);群体间的遗传分化系数(GST)为0.050 7,基因流(Nm)为4.679 6,表明红鳍东方鲀群体间存在低程度的遗传分化和一定程度的基因交流;分子方差分析(AMOVA)表明,遗传变异主要存在于群体内,所占比例为78.49%,而群体之间仅占21.51%;根据群体间Nei氏遗传距离构建UPGMA系统树,群体内个体之间的遗传距离为0.11⁰.82,依据遗传距离的远近将全部个体分成多个分支,不同分支内含有数个个体;各项遗传参数表明,试验群体具备一定程度的遗传变异,不同个体之间拥有相对较远的亲缘关系,可以根据个体之间遗传距离制定育种计划,建立家系进行选育研究。研究表明,利用微卫星标记信息构建红鳍东方鲀家系的方法是切实可行的。