两种致病性弧菌外膜蛋白抗原特性的分析

采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)和苯甲基磺酰氟(PMSF)两种方法提取两种海洋致病性弧菌——鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri和秦皇岛弧菌Vibrio qinhuangdaorasp.nov.的外膜蛋白,并应用SDS-PAGE分析了其外膜蛋白的构成。电泳图谱显示,相对分子质量为44 000、36 000、34 000、26 000、23 000的蛋白条带为两种弧菌外膜蛋白中的共有条带。采用Western-Blotting法比较了两种弧菌外膜蛋白抗原性的异同,结果表明,鱼肠道弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、43 000、34 000、32 000、28 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应;秦皇岛弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应。两种弧菌中均存在相对分子质量为46 000、26 000的外膜蛋白,且具有共同的抗原性。     

虹鳟IPNV分离株VP2蛋白的表达及免疫原性检测

为充分了解中国鱼类传染性胰腺坏死病病毒的系统进化,对流行病学调查分离出的虹鳟Oncorhynchus mykiss传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)分离株进行了系统进化分析,利用软件综合分析了IPNV病毒表面蛋白VP2的跨膜区、亲水性、抗原性和表面可能性,对其特定区段进行了原核表达,并利用表达蛋白制备鼠抗血清及免疫学鉴定。结果表明:本实验室得到的分离株与中国已报道的毒株具有不同的来源;SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP2蛋白为单一条带,相对分子质量约为45 000;ELISA分析显示,利用表达蛋白制备的鼠抗血清与IPNV分离株细胞培养物的效价为1∶20 000,与VP2蛋白的效价为1∶40 000;间接免疫荧光分析显示,细胞感染IPNV病毒24、48 h后,该鼠抗血清均能与IPNV毒株发生特异性反应,并呈现出特异性绿色荧光。研究表明,本研究中表达的VP2蛋白与IPNV病毒的VP2蛋白具有相近的免疫原性,这一结果为IPNV检测方法的建立及疫苗的构建提供了重要的试验依据。     

虹鳟IPNV分离株VP2蛋白的表达及免疫原性检测

为充分了解中国鱼类传染性胰腺坏死病病毒的系统进化,对流行病学调查分离出的虹鳟Oncorhynchus mykiss传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)分离株进行了系统进化分析,利用软件综合分析了IPNV病毒表面蛋白VP2的跨膜区、亲水性、抗原性和表面可能性,对其特定区段进行了原核表达,并利用表达蛋白制备鼠抗血清及免疫学鉴定。结果表明:本实验室得到的分离株与中国已报道的毒株具有不同的来源;SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP2蛋白为单一条带,相对分子质量约为45 000;ELISA分析显示,利用表达蛋白制备的鼠抗血清与IPNV分离株细胞培养物的效价为1∶20 000,与VP2蛋白的效价为1∶40 000;间接免疫荧光分析显示,细胞感染IPNV病毒24、48 h后,该鼠抗血清均能与IPNV毒株发生特异性反应,并呈现出特异性绿色荧光。研究表明,本研究中表达的VP2蛋白与IPNV病毒的VP2蛋白具有相近的免疫原性,这一结果为IPNV检测方法的建立及疫苗的构建提供了重要的试验依据。     

哲罗鲑胰岛素样生长因子Ⅱ cDNA的克隆与组织表达分析

为了研究胰岛素样生长因子-Ⅱ(insulin-like growth factors-Ⅱ,IGF-Ⅱ)在哲罗鲑Hucho taimen生长繁殖过程中所起的作用,根据Gen Bank收录的大西洋鲑IGF-Ⅱ基因开放阅读框序列(NCBI登录号:NM_001123647)设计用于哲罗鲑IGF-Ⅱ开放阅读框扩增的引物,以哲罗鲑肝脏总RNA反转录成的cDNA为模板,利用PCR方法克隆获得哲罗鲑IGF-Ⅱ基因的开放阅读框。生物信息学分析结果显示,哲罗鲑IGF-Ⅱ基因的长度为645 bp,编码含有214个氨基酸残基的蛋白,该蛋白的相对分子质量为24554,等电点为9.92;哲罗鲑IGF-Ⅱ前肽由信号肽、B、C、A、D、E肽6部分构成;同源性比对和系统进化分析结果显示,哲罗鲑IGF-Ⅱ与鲑科鱼类IGF-Ⅱ核苷酸序列同源性最高,聚为一支,其中与大西洋鲑的IGF-Ⅱ同源性最高(98.6%),该基因在进化过程中有着高度保守的进化特性;用荧光定量PCR技术检测2龄哲罗鲑IGF-Ⅱ基因在不同组织中的表达,结果显示,该基因在肝脏中表达量最高,在心脏、鳃、脾、后肠、头肾、胃中的表达量次之,而在前肠和脑中的表达量最低。     

哲罗鲑、细鳞鲑及其杂交种肌肉的营养成分分析

以体质量为38.03⁵5.03 g的哲罗鲑Hucho taimen、细鳞鲑Brachymystax lenok及其杂交种为研究对象,对其肌肉营养成分和氨基酸组成进行了分析评价。结果表明:3种鱼的粗脂肪含量差异显著(P<0.05),杂交种的水分、粗灰分含量高于哲罗鲑低于细鳞鲑,而粗蛋白质含量高于两者;杂交种的人体必需氨基酸和氨基酸总量均高于哲罗鲑和细鳞鲑,而鲜味氨基酸含量低于哲罗鲑高于细鳞鲑;3种鱼的必需氨基酸总量均高于FAO/WHO标准和鸡蛋蛋白标准,以杂交种最高;杂交种的氨基酸评分、化学评分和必需氨基酸指数均远高于哲罗鲑和细鳞鲑,以细鳞鲑最低。研究表明,3种鱼肉质鲜美,营养价值均较高,尤其是杂交种,其肌肉品质更优于哲罗鲑和细鳞鲑,这为哲罗鲑和细鳞鲑的杂交育种提供了参考。     

传染性胰脏坏死病毒VP3抗血清的制备及应用

为丰富传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreas necrosis virus, IPNV)的检测方法,以GenogroupⅠ型的IPNV ChRtm213分离株基因组RNA为模板,利用一步法RT-PCR扩增获得了编码IPNV VP3基因序列(711 bp),将其克隆至pET-32a原核表达载体,利用大肠杆菌Rosetta进行VP3蛋白表达,以纯化的VP3蛋白为免疫原制备鼠抗血清,利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)对抗血清效价进行测定,并利用间接免疫荧光抗体法(indirect immunofluorescent antibody test, IFAT)和中国不同地区的IPNV分离株,对抗血清识别中国现行IPNV分离株的能力进行免疫学鉴定。结果表明:SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP3蛋白条带单一,相对分子质量约为45 000,与理论值相符;抗血清效价分析显示,所制备的鼠抗IPNV VP3血清与IPNV的反应效价为16 000,与纯化的IPNV VP3蛋白的反应效价为32 000;间接免疫荧光抗体法分析显示,制备的鼠抗血清能够特异性识别中国不同地区的GenogroupⅠ和GenogroupⅤIPNV分离株,且该血清不与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(VHSV)发生交叉反应,具备较好的特异性。研究表明,本研究中利用原核表达系统表达的IPNV VP3蛋白具有良好的免疫原性,所制备的IPNV VP3抗血清能够特异性识别中国不同地区的IPNV分离株。     

哲罗鲑胰岛素样生长因子Ⅱ cDNA的克隆与组织表达分析

为了研究胰岛素样生长因子-Ⅱ(insulin-like growth factors-Ⅱ,IGF-Ⅱ)在哲罗鲑Hucho taimen生长繁殖过程中所起的作用,根据Gen Bank收录的大西洋鲑IGF-Ⅱ基因开放阅读框序列(NCBI登录号:NM_001123647)设计用于哲罗鲑IGF-Ⅱ开放阅读框扩增的引物,以哲罗鲑肝脏总RNA反转录成的cDNA为模板,利用PCR方法克隆获得哲罗鲑IGF-Ⅱ基因的开放阅读框。生物信息学分析结果显示,哲罗鲑IGF-Ⅱ基因的长度为645 bp,编码含有214个氨基酸残基的蛋白,该蛋白的相对分子质量为24554,等电点为9.92;哲罗鲑IGF-Ⅱ前肽由信号肽、B、C、A、D、E肽6部分构成;同源性比对和系统进化分析结果显示,哲罗鲑IGF-Ⅱ与鲑科鱼类IGF-Ⅱ核苷酸序列同源性最高,聚为一支,其中与大西洋鲑的IGF-Ⅱ同源性最高(98.6%),该基因在进化过程中有着高度保守的进化特性;用荧光定量PCR技术检测2龄哲罗鲑IGF-Ⅱ基因在不同组织中的表达,结果显示,该基因在肝脏中表达量最高,在心脏、鳃、脾、后肠、头肾、胃中的表达量次之,而在前肠和脑中的表达量最低。     

几种添加剂对哲罗鲑生长和血液生化指标的影响

将哲罗鲑Hucho taimen在室内玻璃钢水族箱中用流水饲养,研究了小肽、柠檬酸、氯化钠和大蒜素对哲罗鲑(6.35 g±0.21 g)摄食、生长、体成分和血清生化指标的影响。养殖周期为56 d,水温9.2¹4.1℃。结果表明:在基础饲料中添加质量分数为1%的小肽后,显著提高了哲罗鲑的增重率和特定生长率(P<0.05),血清总蛋白、白蛋白和球蛋白含量也显著升高(P<0.05),而体成分与对照组差异不大(P>0.05);饲料中添加质量分数为0.5%柠檬酸和1.0%氯化钠对哲罗鲑摄食率、增重率和特定生长率影响不显著(P>0.05),0.5%柠檬酸组哲罗鲑血清甘油三酯、胆固醇和高密度脂蛋白较对照组显著降低(P<0.05);饲料中添加25 mg/kg大蒜素显著降低了哲罗鲑的摄食率、增重率和特定生长率(P<0.05),鱼体水分升高(P<0.05),粗蛋白和粗脂肪降低(P<0.05),血清生化指标变化不显著(P>0.05)。     

仿刺参体腔细胞单克隆抗体的制备及特性分析

应用杂交瘤技术制备了4株稳定分泌抗仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对其单克隆抗体的特性进行了分析。结果表明:单抗1C7和1H7主要结合淋巴样细胞,单抗2E8可与所有体腔细胞结合,单抗4E9主要结合球形细胞;单抗2E8、4E9与仿刺参体腔液具有明显的交叉反应,单抗1C7和1H7则与体腔液无交叉反应;单抗1C7和4E9属于IgG1,2E8属于IgG2a,1H7属于IgM亚型;单抗1C7和1H7均可识别相对分子质量为37 000的蛋白,单抗2E8可同时识别相对分子质量为37 000和61 000两种蛋白,单抗4E9可识别相对分子质量为108 000的蛋白。该单抗的制备为进一步研究仿刺参体腔细胞和体腔液之间的关系,体腔细胞的分类、分布、发生、分化及功能提供了新的工具。     

斜带石斑鱼热休克蛋白基因HSP70在LPS和Poly I∶C刺激下的表达分析及重组蛋白制备

为了解斜带石斑鱼Epinephelus coioides热休克蛋白(HSP70)基因(EcHSP70,GenBank登录号MW411059)在石斑鱼抗病原感染中的功能,采用荧光定量PCR检测了LPS与Poly I∶C刺激后48 h内,石斑鱼脾脏细胞(GS)中EcHSP70的表达变化;构建重组质粒EcHSP70-4T,转化到BL21(DE3)后进行诱导表达,利用SDS-PAGE电泳和Western blot检测EcHSP70重组蛋白的表达形式。结果表明:LPS与Poly I∶C刺激后,石斑鱼脾脏细胞中EcHSP70基因表达量上调;SDS-PAGE与Western blot检测表明,EcHSP70-4T重组蛋白相对分子质量约为96 000,主要以包涵体形式表达。研究表明,EcHSP70蛋白可能参与了石斑鱼的免疫反应,其在大肠杆菌中能以包涵体形式高效表达,并纯化获得了EcHSP70重组蛋白,本研究结果为鉴定EcHSP70的互作蛋白及进一步了解该蛋白在免疫反应中的作用机制提供了数据参考。     

哲罗鱼胚胎和仔鱼发育的研究

用活体观察和固定观察两种方法,首次对哲罗鱼Hucho taimen胚胎和仔鱼发育进行了系统观察,描述了哲罗鱼早期发育过程。哲罗鱼受精卵为沉性端黄卵,呈圆球形,含有大量卵黄,卵色呈桔黄色,吸水膨胀后卵径为(5.55±0.15)mm。在水温为4.8⁹.0℃下,受精卵历时839 h破膜,初孵仔鱼全长为(18.45±0.32)mm,卵黄囊体积为(0.074±0.009)cm3,经过60 d左右仔鱼发育基本完成。将哲罗鱼与几种鱼类进行了对比,探讨其卵径、孵化平均水温与破膜所需时间及初孵仔鱼大小之间的关系。     

大豆分离蛋白替代鱼粉对哲罗鱼消化生理的影响

为研究大豆分离蛋白替代鱼粉后对哲罗鱼Hucho taimen消化系统组织结构和消化酶活性的影响,在水温为9. 8～16. 2℃时,将初始体质量为(6. 90±0. 04) g的哲罗鱼饲养于室内220 L玻璃钢水族箱中,分别投喂大豆分离蛋白替代0、25. 0%、37. 5%、50. 0%、62. 5%、75. 0%、87. 5%和100. 0%鱼粉的饲料,每个处理设3个重复,每个重复放100尾鱼,以含有40. 0%鱼粉的饲料为对照,试验时间为56 d。结果表明:随着鱼粉替代比例的增加,哲罗鱼胃、前肠、幽门盲囊、中肠和胰腺的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均呈显著下降趋势(P<0. 05);肠道绒毛和纹状缘高度亦呈显著下降趋势(P<0. 05);高比例替代鱼粉水平(>75%)时,哲罗鱼肠道组织结构完整性被破坏,纹状缘融合、部分脱落,肝脏空泡化现象严重,形态轮廓逐渐模糊,肝细胞核偏移,且溶解或缺失。研究表明,大豆分离蛋白高比例替代鱼粉水平(>75%)显著降低消化系统消化酶活性,损伤肝脏和肠道组织。     

哲罗鱼仔稚鱼嗅囊发育及其与摄食强度的关系

为掌握哲罗鱼Hucho taimen仔稚鱼嗅囊的发育过程及其与摄食强度的关系,对哲罗鱼仔稚鱼嗅囊发育进行了组织形态学观察,研究了嗅囊发育与摄食强度之间的对应关系,描述了各发育时期的时序和形态特征。结果表明:初孵哲罗鱼仔鱼嗅囊上皮未分化,消化道未有食物充塞度;25~26日龄仔鱼仅有少数个体(11.1%)消化道有一定的食物充塞度(1级);27日龄仔鱼多数个体(占66.7%)开始少量摄食,此时嗅囊上皮仍未分化;29日龄仔鱼均摄食,消化道食物充塞度达到2级和3级的个体分别占44.4%和33.3%;30日龄仔鱼嗅囊上皮从嗅囊基部开始分化;42日龄稚鱼上皮分化更加明显,细胞分化加剧,此时嗅囊上皮分化;45日龄稚鱼均强烈摄食,消化道食物充塞度等级均达到5级,此时嗅囊上皮分化完成;55日龄稚鱼嗅囊形成第一个初级嗅板;85日龄稚鱼嗅囊分化完成,通过光镜和电镜观察,嗅上皮细胞可分为6类,即基细胞、支持细胞、纤毛非感觉细胞、纤毛感觉细胞、柱状细胞和黏液细胞。本研究结果可为哲罗鱼资源的保护和苗种培育提供理论依据。     

哲罗鱼仔稚鱼嗅囊发育及其与摄食强度的关系

为掌握哲罗鱼Hucho taimen仔稚鱼嗅囊的发育过程及其与摄食强度的关系,对哲罗鱼仔稚鱼嗅囊发育进行了组织形态学观察,研究了嗅囊发育与摄食强度之间的对应关系,描述了各发育时期的时序和形态特征。结果表明:初孵哲罗鱼仔鱼嗅囊上皮未分化,消化道未有食物充塞度;25²6日龄仔鱼仅有少数个体(11.1%)消化道有一定的食物充塞度(1级);27日龄仔鱼多数个体(占66.7%)开始少量摄食,此时嗅囊上皮仍未分化;29日龄仔鱼均摄食,消化道食物充塞度达到2级和3级的个体分别占44.4%和33.3%;30日龄仔鱼嗅囊上皮从嗅囊基部开始分化;42日龄稚鱼上皮分化更加明显,细胞分化加剧,此时嗅囊上皮分化;45日龄稚鱼均强烈摄食,消化道食物充塞度等级均达到5级,此时嗅囊上皮分化完成;55日龄稚鱼嗅囊形成第一个初级嗅板;85日龄稚鱼嗅囊分化完成,通过光镜和电镜观察,嗅上皮细胞可分为6类,即基细胞、支持细胞、纤毛非感觉细胞、纤毛感觉细胞、柱状细胞和黏液细胞。本研究结果可为哲罗鱼资源的保护和苗种培育提供理论依据。     

饥饿对哲罗鱼仔鱼形态、行为和消化器官结构的影响

研究了饥饿对哲罗鱼Hucho taimen仔鱼形态和行为的影响,采用解剖和石蜡切片方法,对饥饿条件下哲罗鱼仔鱼消化系统组织学进行了研究。结果表明:饥饿后仔鱼出现反应迟钝、游动缓慢和集群性降低等行为,并出现身体发黑、头大身瘦、肝脏体积减小、消化管长度增速减慢和消化管组织学结构与功能明显衰退等特点。食道黏膜层黏液细胞不断萎缩,最后出现破裂;胃腺结构严重破坏,胃肌纤维疏松呈网状。肠黏膜层破损,肠绒毛不整齐,个别地方出现萎缩、断裂,黏液细胞出现破裂。饥饿仔鱼肝组织较为疏松,最后细胞索被破坏,肝细胞间分界模糊,核仁萎缩或解体。分析认为,肝脏为仔鱼较重要的能量贮存器官,胃与肠的褶皱高度可作为哲罗鱼仔鱼营养状况的指示物;哲罗鱼仔鱼0～12 d为可存活摄食时间,0～8 d为最佳摄食时间。