刺参4个功能基因的表达分析

为研究刺参Apostichopus japonicus的生长发育,采用实时定量PCR方法,对刺参腱生蛋白基因、胶原蛋白α2基因、整合蛋白αV基因和整合蛋白βL基因等4个候选功能基因不同月龄的组织表达进行了分析。结果表明:刺参12、13、14月龄时,腱生蛋白基因在刺参肠、管足、呼吸树、皮肤、体壁、体腔液细胞、疣足和纵肌等8个组织中均有不同程度的表达,其中在体腔液细胞和呼吸树组织中的表达量较高(P<0.05);胶原蛋白α2基因在刺参管足、呼吸树、体壁、疣足和纵肌组织中的表达量随月龄的增加而逐渐增加,其中在呼吸树组织中表达量最高,在纵肌、疣足、体壁、肠和体腔液细胞等组织中的表达量逐渐降低;整合蛋白αV基因在纵肌组织中的表达量随月龄的增加而逐渐增加;整合蛋白βL基因在皮肤、体壁、疣足和管足组织中的表达量较低。本研究结果为深入研究刺参这4个功能基因提供了参考。     

低盐胁迫下仿刺参DD104基因的定量表达分析

以2龄仿刺参Apostichopus japonicus为试验材料,利用实时定量PCR技术分析了DD104基因在仿刺参不同组织中以及低盐胁迫后不同时间的表达情况。结果表明:DD104基因在仿刺参管足中的表达水平最高,在体腔液、触手、呼吸树中的表达水平次之,在体壁、肌肉和肠中的表达水平较低;仿刺参在受到低盐胁迫后,体内DD104 mRNA的表达随盐度胁迫时间的增加呈现波动性增减,胁迫72 h时DD104基因的表达最强,在肌肉和管足中的表达量达到最大;胁迫48 h时肠组织中的表达量最大;胁迫24 h时体腔液中的表达量最大。研究表明,低盐胁迫后DD104基因在仿刺参不同组织中的表达发生变化的时间点不同,低盐胁迫下DD104基因表达量的变化规律说明该基因的表达可能与渗透胁迫密切相关。     

盐度应激下刺参4个转运相关基因的适应表达研究

为研究急性低盐18胁迫对刺参Apostichopus japonicus盐度调节相关基因表达的影响,在实验室条件下,以盐度30为对照组,72 h为1个盐度波动周期,采用荧光定量的方法进行了刺参(16. 93 g±3. 08 g)不同组织不同时间段单羧酸转运蛋白家族16a13 (Monocarboxylate Transporters 13,SLC16a13)基因、单羧酸转运蛋白家族6a8 (Solute Carrier Family 6 Member 8,SLC6a8)基因、甲壳素受体蛋白(Fibrinogen C Domain-Containing Protein 1,FIBCD1)基因和AMPA型谷氨酸受体1 (Glutamate Ionotropic Receptor AMPA Type Subunit 1,Gria1)基因4个与盐度调节有关的基因差异表达分析。结果表明:SLC16a13、SLC6a8、FIBCD1、Gria1基因均在刺参不同组织中检测到且有不同程度的表达,这4个基因在刺参体腔液、肠、呼吸树中均有表达;在6、12、48 h时,刺参体腔液中SLC16a13基因的表达量均显著高于对照组(P <0. 05),在肠组织中,该基因的表达量在1. 5、3 h时与对照组无显著性差异(P> 0. 05),在其余时间点均显著高于对照组(P<0. 05),在72 h时表达量达到最高,在呼吸树组织中,该基因表达量在各时间点均显著上调(P<0. 05),在72 h表达量达到最高;试验过程中,SLC6a8基因在体腔液中的表达量显著高于其他组织(P<0. 05);总体上FIBCD1基因在体腔液中表达最高,在呼吸树中次之,在肠中最低;总体上Gria1基因在肠组织中表达最高,在体腔液中次之,在呼吸树中最低。本研究结果为刺参对环境的适应机制研究提供了数据资料。     

刺参温度相关基因在模拟不同海域冬春季水温条件下的表达研究

为探讨不同海域冬春季水温对刺参温度相关基因的表达影响,在实验室内模拟了俄罗斯沿海地区、大连沿海地区、福建沿海地区12月至翌年4月刺参Apostichopus japonicus生长的海水温度,并从已构建的刺参耐寒基因筛选cDNA文库和刺参高温胁迫正反消减cDNA文库中选取了7个差异基因:hsp70、gp96、UQCRFS1、ferritin、lysozyme、mtLSU、proeintl(2)efl,利用实时荧光定量PCR方法研究了这7个基因在3种海域冬春季模拟水温条件下的表达情况。结果表明:3个水温组刺参同一组织中hsp70基因的表达量变化不明显,但在不同组织中的表达量存在差异;模拟福建沿海地区冬春季水温组刺参各组织中gp96基因的表达量整体上均高于其他两个水温组,并且在模拟福建沿海地区冬春季水温组刺参呼吸树中的表达量显著高于该组肠和体壁(P<0.05);模拟俄罗斯沿海地区冬春季水温组刺参各组织中UQCRFS1基因的表达量均高于其他两个水温组;3个水温组刺参各组织中ferritin基因的表达模式及表达量均不相同;3个水温组刺参各组织中lysozyme和proeintl(2)efl两个基因的表达量均在呼吸树中达到最高,且显著高于肠和体壁(P<0.05);3个水温组刺参各组织中mt LSU基因的表达模式基本相同,其表达量均表现为体壁显著高于肠和呼吸树(P<0.05)。     

刺参26S蛋白酶体S7亚基基因的克隆与组织表达分析

应用RACE法从刺参Apostichopus japonicus体腔细胞中克隆出26S蛋白酶体组成19S亚复合体亚基之一的S7亚基基因(GenBank登录号:JQ922514)。该基因的cDNA序列全长为2 445 bp,其中5'UTR为70bp,3'UTR为1 070 bp,开放阅读框为1 305 bp,编码435个氨基酸;保守区具有典型的ATP结合和水解基序,氨基酸序列分别为GPPGTGKT和DEID,具有MAT和VRPGRLDR的RNA/DNA螺旋酶的特征性基序;刺参26S蛋白酶体S7亚基基因与紫海胆的氨基酸序列同源性最高(95%),与脊椎动物、节肢动物的同源性较高(88%⁸9%),与线虫、拟南芥和酵母同源性较低(85%、77%和73%);S7亚基编码的蛋白没有信号肽,也没有跨膜结构域,为非跨膜蛋白,定位于细胞中的液态基质中。采用实时定量PCR方法检测了26S蛋白酶体S7亚基基因在刺参5种组织中的表达情况,结果显示,在肠、呼吸树、表皮、体腔细胞、纵肌中26S蛋白酶体S7基因均有明显表达,且体腔细胞中表达量最高,其次是纵肌和肠,在体壁和呼吸树中表达量较低。本研究中首次在刺参体内发现并克隆了26S蛋白酶体S7亚基基因,同时采用Realtime PCR技术对该基因的表达部位进行了研究,所得结果将为研究棘皮动物蛋白质代谢途径提供新的着眼点,为刺参生理功能的调控研究奠定了基础。     

中间球海胆smad2/3基因克隆、组织表达及其脂多糖刺激响应

为明确中间球海胆Strongylocentrotus intermedius smad2/3基因(命名为Si-smad2/3)信息,初步研究了该基因的序列特征、组织表达模式及脂多糖对其表达的影响,采用RACE技术克隆获得了成体中间球海胆Si-smad2/3基因的全长cDNA序列。结果表明:Si-smad2/3基因的cDNA全长为2146 bp,共编码446个氨基酸;生物信息学分析发现,Si-smad2/3基因所编码的蛋白相对分子质量为50 300,等电点为6.93,属于亲水性非跨膜蛋白;通过与9种已公布物种的smad2/3蛋白氨基酸序列进行多重序列比对和系统进化分析发现,中间球海胆Si-smad2/3蛋白的氨基酸序列与其他真核生物smad2/3蛋白序列具有较高的相似性,与紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus smad2/3蛋白的一致性高达96%,符合中间球海胆的分类和进化地位;实时定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示,Si-smad2/3基因在中间球海胆不同组织中均有表达,其相对表达量从高到低为体腔细胞>管足>性腺>围口膜>肠>齿间肌;利用脂多糖(LPS,0.1 mg/mL)对中间球海胆进行免疫刺激发现,与对照组相比,LPS刺激后Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞、管足和围口膜中均呈先升高后降低的表达趋势,其中,Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞中的相对表达量在LPS刺激9 h时达到峰值,管足中表达量在LPS刺激6 h时达到峰值,而围口膜中的表达量在LPS刺激72 h时达到峰值。研究表明,Si-smad2/3可能参与中间球海胆的免疫应答过程且免疫响应具有组织特异性。     

中间球海胆smad2/3基因克隆、组织表达及其脂多糖刺激响应

为明确中间球海胆Strongylocentrotus intermedius smad2/3基因(命名为Si-smad2/3)信息,初步研究了该基因的序列特征、组织表达模式及脂多糖对其表达的影响,采用RACE技术克隆获得了成体中间球海胆Si-smad2/3基因的全长cDNA序列。结果表明:Si-smad2/3基因的cDNA全长为2146 bp,共编码446个氨基酸;生物信息学分析发现,Si-smad2/3基因所编码的蛋白相对分子质量为50 300,等电点为6.93,属于亲水性非跨膜蛋白;通过与9种已公布物种的smad2/3蛋白氨基酸序列进行多重序列比对和系统进化分析发现,中间球海胆Si-smad2/3蛋白的氨基酸序列与其他真核生物smad2/3蛋白序列具有较高的相似性,与紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus smad2/3蛋白的一致性高达96%,符合中间球海胆的分类和进化地位;实时定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示,Si-smad2/3基因在中间球海胆不同组织中均有表达,其相对表达量从高到低为体腔细胞>管足>性腺>围口膜>肠>齿间肌;利用脂多糖(LPS,0.1 mg/mL)对中间球海胆进行免疫刺激发现,与对照组相比,LPS刺激后Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞、管足和围口膜中均呈先升高后降低的表达趋势,其中,Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞中的相对表达量在LPS刺激9 h时达到峰值,管足中表达量在LPS刺激6 h时达到峰值,而围口膜中的表达量在LPS刺激72 h时达到峰值。研究表明,Si-smad2/3可能参与中间球海胆的免疫应答过程且免疫响应具有组织特异性。     

用改良的TRIZOL法快速提取仿刺参和中间球海胆的总RNA

用改良的TRIZOL法和普通TRIZOL法分别提取仿刺参Apostichopus japonica体壁、肠、体腔液和中间球海胆Strongylocentrotus intermedius的管足、性腺、齿间肌的总RNA。结果表明:用普通TRIZOL法提取时间长,电泳条带不很清晰,存在降解且各个组织提取的状况不稳定,杂质量多;而用改良TRIZOL法能够快速提取仿刺参、海胆组织的总RNA,电泳后得到的28S rRNA和18S rRNA条带清晰、完整性好、纯度高、得率高,其A/A为2.04².14,总RNA浓度为44.962.14,总RNA浓度为44.96¹15.02 ng/μL。     

镉对刺参幼参体内金属硫蛋白含量及其变化规律的影响

为评价水体中镉(Cd~(2+))对刺参Apostichopus japonicus体内金属硫蛋白(MT)的诱导效果,以刺参幼参(体质量8.87 g±1.12 g)为研究对象,在水温16~18℃下,探讨水体中不同浓度Cd~(2+)(<0.005、0.025、0.050、0.250、0.500 mg/L)胁迫下幼参体内MT含量随Cd~(2+)胁迫时间(0、12、36、60、84、108h)的变化规律。结果表明:随着Cd~(2+)胁迫时间的延长,幼参肠道、呼吸树和体壁中MT含量呈先升高后趋于平稳的趋势,且在36 h时各组织中MT含量最高或相对较高;Cd~(2+)胁迫36 h时,幼参体内MT含量依次为肠道>呼吸树>体壁,且Cd~(2+)胁迫后幼参各组织间MT含量有显著性差异(P<0.05);各时间点下,Cd~(2+)浓度试验组幼参肠道、呼吸树和体壁中MT含量均显著高于对照组(P<0.05);在Cd~(2+)胁迫各时间点,幼参肠道和呼吸树中MT含量随Cd~(2+)浓度的升高呈显著"阶梯式"升高(P<0.05),体壁中MT含量则随Cd~(2+)浓度的升高而升高,Cd~(2+)浓度为0.025、0.050 mg/L时,体壁中MT含量相差不大(P>0.05),但均显著低于Cd~(2+)浓度最高组(0.500 mg/L)(P<0.05)。研究表明,水体中的Cd~(2+)可诱导刺参组织合成金属硫蛋白,其中对肠道和呼吸树的诱导效果最明显,36 h即可达到较为显著的诱导效果,因此,刺参肠道和呼吸树组织中的MT含量可作为评价水体中重金属Cd~(2+)污染的生物标志物。     

镉对刺参幼参体内金属硫蛋白含量及其变化规律的影响

为评价水体中镉(Cd⁽²⁺⁾)对刺参Apostichopus japonicus体内金属硫蛋白(MT)的诱导效果,以刺参幼参(体质量8.87 g±1.12 g)为研究对象,在水温16(2+))对刺参Apostichopus japonicus体内金属硫蛋白(MT)的诱导效果,以刺参幼参(体质量8.87 g±1.12 g)为研究对象,在水温16¹8℃下,探讨水体中不同浓度Cd18℃下,探讨水体中不同浓度Cd⁽²⁺⁾(<0.005、0.025、0.050、0.250、0.500 mg/L)胁迫下幼参体内MT含量随Cd(2+)(<0.005、0.025、0.050、0.250、0.500 mg/L)胁迫下幼参体内MT含量随Cd⁽²⁺⁾胁迫时间(0、12、36、60、84、108h)的变化规律。结果表明:随着Cd(2+)胁迫时间(0、12、36、60、84、108h)的变化规律。结果表明:随着Cd⁽²⁺⁾胁迫时间的延长,幼参肠道、呼吸树和体壁中MT含量呈先升高后趋于平稳的趋势,且在36 h时各组织中MT含量最高或相对较高;Cd(2+)胁迫时间的延长,幼参肠道、呼吸树和体壁中MT含量呈先升高后趋于平稳的趋势,且在36 h时各组织中MT含量最高或相对较高;Cd⁽²⁺⁾胁迫36 h时,幼参体内MT含量依次为肠道>呼吸树>体壁,且Cd(2+)胁迫36 h时,幼参体内MT含量依次为肠道>呼吸树>体壁,且Cd⁽²⁺⁾胁迫后幼参各组织间MT含量有显著性差异(P<0.05);各时间点下,Cd(2+)胁迫后幼参各组织间MT含量有显著性差异(P<0.05);各时间点下,Cd⁽²⁺⁾浓度试验组幼参肠道、呼吸树和体壁中MT含量均显著高于对照组(P<0.05);在Cd(2+)浓度试验组幼参肠道、呼吸树和体壁中MT含量均显著高于对照组(P<0.05);在Cd⁽²⁺⁾胁迫各时间点,幼参肠道和呼吸树中MT含量随Cd(2+)胁迫各时间点,幼参肠道和呼吸树中MT含量随Cd⁽²⁺⁾浓度的升高呈显著"阶梯式"升高(P<0.05),体壁中MT含量则随Cd(2+)浓度的升高呈显著"阶梯式"升高(P<0.05),体壁中MT含量则随Cd⁽²⁺⁾浓度的升高而升高,Cd(2+)浓度的升高而升高,Cd⁽²⁺⁾浓度为0.025、0.050 mg/L时,体壁中MT含量相差不大(P>0.05),但均显著低于Cd(2+)浓度为0.025、0.050 mg/L时,体壁中MT含量相差不大(P>0.05),但均显著低于Cd⁽²⁺⁾浓度最高组(0.500 mg/L)(P<0.05)。研究表明,水体中的Cd(2+)浓度最高组(0.500 mg/L)(P<0.05)。研究表明,水体中的Cd⁽²⁺⁾可诱导刺参组织合成金属硫蛋白,其中对肠道和呼吸树的诱导效果最明显,36 h即可达到较为显著的诱导效果,因此,刺参肠道和呼吸树组织中的MT含量可作为评价水体中重金属Cd(2+)可诱导刺参组织合成金属硫蛋白,其中对肠道和呼吸树的诱导效果最明显,36 h即可达到较为显著的诱导效果,因此,刺参肠道和呼吸树组织中的MT含量可作为评价水体中重金属Cd⁽²⁺⁾污染的生物标志物。