BMP9经Smad信号通路调控iSCAP成骨/成牙本质分化

目的:研究BMP9是否能够激活i SCAP细胞中的Smad信号通路,以及Smad信号通路在BMP9诱导i SCAP细胞成骨/成牙本质向分化过程中的作用。方法:首先,采用Western印迹实验检测Ad-BMP9转染i SCAP后Smad1/5/8蛋白的磷酸化水平。随后,利用dn ALK1重组腺病毒和BMP9条件培养基作用于i SCAP,Western印迹实验检测Smad1/5/8蛋白磷酸化水平;采用碱性磷酸酶(ALP)活性检测和染色方法分析早期成骨/成牙本质指标变化,茜素红染色法检测钙盐沉积程度;RT-PCR成骨/成牙本质相关基因Runx2、OCN、OPN和DMP1表达的影响。结果:BMP9可上调i SCAP中Smad1/5/8的磷酸化水平;dn ALK1抑制BMP9条件培养基作用后,可抑制Smad1/5/8的磷酸化,i SCAP细胞中早期成骨/成牙本质标志物ALP活性和晚期成骨/成牙本质标志钙盐结节减少,重要成骨转录因子Runx2基因表达减少,成骨/成牙本质相关基因OCN、OPN、DMP1的表达也受到了抑制。结论:Smad信号通路在BMP9诱导i SCAP成骨/成牙本质过程中存在并起着重要作用。     

PKA对斑马鱼前肾发育的影响及其机制研究

作为一个胞内蛋白激酶,PKA在中枢神经系统、眼睛和肢体等形态发生中担任了重要角色,并参与多种细胞行为,但其在肾脏发育中的作用却不十分清楚。以斑马鱼为模式动物,采用原位杂交和冰冻切片技术检测PKA在斑马鱼中的表达情况;通过显微注射反义吗啉环寡核苷酸的方式,抑制内源性PKA的表达;通过免疫荧光技术,检测斑马鱼前肾的微观结构。结果显示:编码斑马鱼PKA催化亚基的prkaa1和编码调节亚基的prkab1b均为母源基因,并且在肾管上皮细胞中有特异性表达;分别抑制内源性prkaa1或prkab1b的表达,胚胎于第3天呈现高比例的心脏水肿(分别为54.4%和77.3%)和体轴弯曲(分别为48.5%和72.6%)以及极低比例的多囊肾表型(<5%);进一步检测发现,抑制PKA会导致肾管上皮细胞迁移缺陷,尤其是阻碍肾管多纤毛细胞迁移,继而引起肾管前中部不同程度肿大,并最终导致胚胎死亡。该研究表明,PKA可能通过调控斑马鱼肾管上皮细胞迁移从而在肾脏发育中发挥作用。     

DLX1对BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响

目的:分析和确认转录因子DLX1在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:首先,BMP9腺病毒感染C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测DLX1表达变化;随后,利用重组腺病毒技术分别过表达DLX1和RNA干扰(RNA Intenference,RNAi)抑制DLX1的表达,并利用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色、钙盐沉积实验(茜素红染色),免疫细胞化学检测骨钙素(osteocalcin,OCN)表达和裸鼠皮下异位成骨实验分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的影响。荧光素酶报告基因实验和Western blot分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞Smad1/5/8信号途径的影响。结果:BMP9可以促进C3H10T1/2细胞中DLX1基因和蛋白表达水平;过表达DLX1在体外可进一步促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积以及OCN的表达,过表达DLX1亦可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨;反之,RNAi抑制DLX1表达后,由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均相应受到抑制。过表达DLX1可进一步增强BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中Smad/1/5/8的转录调控活性,RNAi降低DLX1表达则可抑制BMP9诱导Smad/1/5/8的转录调控活性。但是,无论过表达DLX1和RNAi降低DLX1表达均不会对BMP9诱导的Smad/1/5/8磷酸化造成影响。结论:DLX1可以调节BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化,其调节作用可能是通过影响Smad1/5/8信号的转录调控活性而实现的。     

斑马鱼中骨形态发生蛋白2a敲降对骨代谢的影响

目的通过显微注射吗啉环反义寡核苷酸(morpholino oligo,MO),使斑马鱼骨形态发生蛋白2a (bone morphgenetic protein 2a,BMP2a)基因敲降,观察BMP2a基因表达抑制后对斑马鱼骨代谢的影响。方法以受精后半小时斑马鱼受精卵为模型,将MO显微注射到受精卵(20个,对照组相同处理),对注射MO后及野生型(wild type,WT)的幼鱼于第9天分别进行茜素红染色,比较硬骨的形态差异,同时运用Image J软件对染色体积进行统计,比较差异。对注射MO后的幼鱼于第4天提取的c DNA采用实时荧光定量PCR(QPCR)方法检测Runx2a、Runx2b、Sp7、Alp骨形成相关基因和WT基因组的成骨下游基因表达的差异。对注射MO后第4天的斑马鱼予以成骨代表性的两个基因Runx2a进行原位杂交,比较WT幼鱼相关成骨基因表达部位的差异和信号强弱。结果与WT染色相比,注射抑制BMP2a的MO后第9天斑马鱼硬骨茜素红染色变浅,体积更小(MO vs. WT:3 276±153 vs. 4 768±231,P<0. 05)。QPCR检测显示,注射MO后第4天的斑马鱼成骨代谢基因表达量与WT斑马鱼对应基因相比均下调(Runx2a:0. 348±0. 002 vs. 1. 007±0. 032;Runx2b:0. 525±0. 021 vs. 1. 013±0. 021; Sp7:0. 483±0. 026 vs. 1. 124±0. 173; Alp:0. 136±0. 012 vs. 1. 233±0. 237; P<0. 05)。就Runx2a原位杂交而言,注射MO后第4天斑马鱼信号表达弱于同期WT斑马鱼。结论通过基因敲降技术使得斑马鱼BMP2下调,直观地观察到斑马鱼的骨发育迟缓,运用分子手段发现其基因下调造成一系列的成骨基因降低,用原位半定量方法靶向定位到斑马鱼蝶骨上,基因下调后造成斑马鱼的蝶骨信号消失。     

斑马鱼Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)质粒的构建及验证

为研究性腺体衍生因子基因(gsdf)在斑马鱼Danio rerio精巢发育过程中相关分子调控机制模型,提取了斑马鱼精巢总RNA,逆转录合成c DNA,并以其为模板,用RT-PCR法扩增得到gsdf基因,构建了以小鼠gamma-crystalin启动子启动的斑马鱼gsdf基因与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)融合的荧光素酶报告质粒Tg (Crystal-pro-gsdf-2A-egfp),采用显微注射技术注射该质粒至1细胞期的斑马鱼受精胚胎中。结果表明:在荧光显微镜下观察到19尾能在眼部晶状体中特异表达绿色荧光蛋白基因(gfp)的F0代斑马鱼,将表达了绿色荧光蛋白基因的斑马鱼同野生型(WT)非转基因斑马鱼杂交,最终获得能特异表达绿色荧光蛋白基因的F2代,且gsdf基因能在斑马鱼眼部晶状体中特异表达并稳定遗传。研究表明,在斑马鱼上建立的Tg (Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)转基因品系,为研究和观察斑马鱼精巢发育的分子调控机制提供了新的方法。     

斑马鱼miR-30e对血细胞生成的作用机制研究

microRNA(简写为miRNA)是一类内源基因编码的单链RNA分子,参与转录后基因的表达调控,在血液生成过程中起着重要作用。为研究miR-30e对鱼类血液生成的作用机制,以斑马鱼Danio rerio作为模式生物,针对青藏高原裂腹鱼血液组织中高表达的miR-30e,利用生物信息软件预测斑马鱼miR-30e的靶基因,构建含斑马鱼ALAS2-3′UTR序列的双荧光素酶报告质粒与斑马鱼miR-30e进行共转染,检测细胞双荧光素酶活性的变化;同时构建含斑马鱼ALAS2-3′UTR序列的绿色荧光蛋白质粒,与miR-30e共同显微注射斑马鱼胚胎,观察GFP荧光强度与蛋白表达量的变化。结果表明:斑马鱼胚胎在注射miR-30e模拟体48 h后,其血红蛋白表达明显减少;转染miR-30e的293T细胞双荧光素酶活性显著降低(P<0.05);斑马鱼胚胎注射miR-30e模拟体24 h后,其GFP荧光强度明显降低,且GFP蛋白表达量明显减少。研究表明,ALAS2基因是miR-30e的一个靶基因,miR-30e通过抑制ALAS2表达而抑制血红细胞的生成。     

Cas9-CRISPR敲除hae3基因对斑马鱼血红蛋白生成的影响

为获得hae3基因缺失的突变体,并研究hae3基因对血红蛋白生成的影响,以斑马鱼Danio rerio为研究对象,利用Cas9-CRISPR技术,成功建立了缺失血红蛋白hae3基因的鱼类模型,采用显微注射技术将hae3 sgRNA与Cas9 RNA混合后对斑马鱼第一细胞期受精卵动物极进行注射,利用序列测定与比对、T7核酸酶酶切方法成功检测到了hae3基因的敲除,并对缺失hae3基因的斑马鱼和对照组斑马鱼同时进行固蓝(O-dianisidine)染色。结果表明,与对照组相比,试验组斑马鱼血红蛋白含量明显下降,并有畸形表型。研究表明,胚胎时期hae3基因的缺失会严重影响斑马鱼血红蛋白的生成,而且伴随畸形发育表型。     

Cas9-CRISPR敲除hae3基因对斑马鱼血红蛋白生成的影响

为获得hae3基因缺失的突变体,并研究hae3基因对血红蛋白生成的影响,以斑马鱼Danio rerio为研究对象,利用Cas9-CRISPR技术,成功建立了缺失血红蛋白hae3基因的鱼类模型,采用显微注射技术将hae3 sgRNA与Cas9 RNA混合后对斑马鱼第一细胞期受精卵动物极进行注射,利用序列测定与比对、T7核酸酶酶切方法成功检测到了hae3基因的敲除,并对缺失hae3基因的斑马鱼和对照组斑马鱼同时进行固蓝(O-dianisidine)染色。结果表明,与对照组相比,试验组斑马鱼血红蛋白含量明显下降,并有畸形表型。研究表明,胚胎时期hae3基因的缺失会严重影响斑马鱼血红蛋白的生成,而且伴随畸形发育表型。     

低温胁迫下鱼类鳃中RPL11/MDM2/P53信号通路相关基因及蛋白表达差异分析

为了研究RPL11/MDM2/P53信号通路在鱼类低温胁迫中所起的作用,分别利用mRNA和蛋白表达水平定量技术,对罗非鱼Oreochromis niloticus和斑马鱼Danio rerio两种抗寒能力不同的鱼类鳃RPL11/MDM2/P53信号通路相关因子在低温胁迫下的表达情况进行分析。结果表明:在相同低温胁迫下,罗非鱼鳃中RPL11和P53蛋白表现出随着低温胁迫时间延长而增加的趋势,但斑马鱼鳃中P53蛋白开始增加的时间点晚于罗非鱼;罗非鱼鳃中mdm2转录表达量在8℃、6 h后显著升高(P<0.05),表明mdm2表达量升高可能活化P53;8℃、6 h后P53下游靶基因bad和p21在罗非鱼鳃中出现表达量升高的情况,这与罗非鱼中6 h时P53蛋白表达量升高是一致的,但在斑马鱼中p21基因表达量变化不大。研究表明,低温能诱导罗非鱼中与凋亡相关的RPL11/MDM2/P53通路中相关蛋白的变化,并且这种表达变化模式与耐低温能力较强的斑马鱼不同,这种物种差异性的基因表达模式可能是不同鱼类低温耐受能力差异的原因之一。     

低温胁迫下鱼类鳃中RPL11/MDM2/P53信号通路相关基因及蛋白表达差异分析

为了研究RPL11/MDM2/P53信号通路在鱼类低温胁迫中所起的作用,分别利用mRNA和蛋白表达水平定量技术,对罗非鱼Oreochromis niloticus和斑马鱼Danio rerio两种抗寒能力不同的鱼类鳃RPL11/MDM2/P53信号通路相关因子在低温胁迫下的表达情况进行分析。结果表明:在相同低温胁迫下,罗非鱼鳃中RPL11和P53蛋白表现出随着低温胁迫时间延长而增加的趋势,但斑马鱼鳃中P53蛋白开始增加的时间点晚于罗非鱼;罗非鱼鳃中mdm2转录表达量在8℃、6 h后显著升高(P<0.05),表明mdm2表达量升高可能活化P53;8℃、6 h后P53下游靶基因bad和p21在罗非鱼鳃中出现表达量升高的情况,这与罗非鱼中6 h时P53蛋白表达量升高是一致的,但在斑马鱼中p21基因表达量变化不大。研究表明,低温能诱导罗非鱼中与凋亡相关的RPL11/MDM2/P53通路中相关蛋白的变化,并且这种表达变化模式与耐低温能力较强的斑马鱼不同,这种物种差异性的基因表达模式可能是不同鱼类低温耐受能力差异的原因之一。     

住宅楼安装中央空调的加固案例分析

文章通过两处住宅用房安装中央空调的事例,现场查勘、验算与鉴定,证实了在住宅用房的混凝土梁上钻孔洞安装中央空调管线的做法,影响了房屋结构的安全,同时给出了加固处理意见,提出了个人的几点看法.     

Regularities of development of settling of models of deep footings

Conclusions 1. The effect of relative penetration on the change in magnitude of settlement is substantial. With the same specific pressure on the base the settlement of the model decreases as the relative penetration increases.2. Published data on values of unit friction forces along lateral surfaces of deep foundations were confirmed. The maximum value of resistance along the side surface was 2 tons/m².3. It was established that the realtionship between the settlement of the model and its diameter is nonlinear. This is of great importance in working out a method for calculating foundations of deep footings from deformations especially if one considers that in this case the foundation carries substantial pressures and deforms under conditions of strongly developed shear regions.Translated from Osnovaniya, Fundamenty i Mekhanika Gruntov, No. 6, pp. 11–12, November–December, 1971.     

测量标志普查资料汇集技术处理

为了适应新的形势发展需要,安徽省国土资源厅已启动新一轮测量标志普查工作。与过去不同,此次普查在资料汇集、调查人员组织、调查资料归档与调用等方面做了较大变革,文章简明阐述了变革后的测量标志普查资料汇集技术处理的过程。     

自动扶梯逆行故障成因与分析

对自动扶梯突然反转而导致逆行故障的类别和成因进行了分析,讨论了逆行速度及症状,分析了逆行概率及风险,并针对逆行提出了一些对策。     

浅析步行街的建筑工效学——上海市吴江路步行街建筑工效学调研

从建筑工效学的角度对上海市吴江路休闲步行街进行了调查研究，根据调查结果，分析了其在建筑工效学上的一些特点与不足之处并进行了探讨，以期对步行街的建筑工效学设计提供准确的参考。     

环境的共鸣--大连水产学院图书馆的设计

本文通过对大连水产学院图书馆的介绍,向人们展示了建筑与环境之间相辅相成,共同作用,引起环境共鸣的原则方法.     

浅谈饲料中有效能的测定技术

饲料中有效能是供动物生长发育的基础。不同动物所用的有效能体系不同,目前大多数动物采用消化能、代谢能体系,但随着研究的发展与深入,发现最能反映饲料有效能的是净能体系。无论哪种体系,采用合理的测定技术准确测定饲料中的有效能值显得尤其重要,通过对饲料有效能值的准确测定可以实现动物所需能量的精确供给,减少养殖成本,使经济效益最大化。文章综述了几种有效能评价体系的测定技术。     

混凝土碳化深度的灰色预测

混凝土碳化是导致钢筋混凝土结构耐久性损伤的主要原因之一。为了预测混凝土碳化深度,本文建议采用一种基于灰色系统理论的预测模型,该模型可以根据已知的混凝土碳化序列,较精确地预测未来时刻的碳化深度。文章最后以实例说明了该模型的应用。