双齿围沙蚕消化道共栖微生物菌群多样性的PCR-DGGE分析

将采自青岛市沿海潮间带的双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis(体质量为4～5 g)置于无菌海水中暂养24 h后,分别从5条双齿围沙蚕消化道中提取微生物基因组总DNA,应用细菌16S rDNA通用引物341f/534r进行细菌16S rDNA基因V3高变异区的PCR扩增,再将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),从而获得样品消化道共栖微生物群落特征的DNA指纹图谱。通过对指纹图谱半定量分析发现,采集的双齿围沙蚕消化道共栖微生物菌群多样性丰富,优势条带明显,不同个体间既存在共同的微生物种属,也有各自特异的种属。其中存在一条共同的优势条带,但优势条带含量存在个体间差异。分别对DGGE指纹图谱中公共条带序列进行测序比对,结果表明,产丙酸菌属Propionigenium分别为5个样品中的优势菌群,假交替单胞菌属Pseudoalteromonas广泛分布于双齿围沙蚕消化道中。研究表明,基于16S rDNA的PCRDGGE图谱技术是分析双齿围沙蚕及其他海洋沉积食性无脊椎动物消化道微生物菌群结构较为有效的手段。     

不同养殖时期刺参肠道内菌群结构的分析

为研究不同养殖时期刺参Apostichopus japonicus肠道内的细菌菌群结构,采用PCR-DGGE技术对DGGE凝胶中的主要条带进行切割、回收、克隆、测序。结果表明:3、4、5、6、9、10月,大连瓦房店海区养殖刺参肠道内细菌16S r DNA-V3可变区序列经PCR扩增及DGGE电泳后分别获得49、49、54、53、52、51个条带;3月与9月的菌群结构相似度最高,为67.9%,4月与10月次之,为63.8%;经条带序列分析得到43个主要条带对应的核酸序列,11个与未培养菌相似,32个与归属为7个细菌类群的细菌序列相似,包括α-变形菌纲、γ-变形菌纲、δ-变形菌纲、黄杆菌纲、蓝藻纲、绿弯菌门、疣微菌门;α-变形菌纲、γ-变形菌纲、黄杆菌纲是不同养殖时期刺参肠道内的主要细菌群落,其中γ-变形菌纲所占比例最高,达25.00%³5.71%,除3月和9月外,黄杆菌纲的相对含量均高于α-变形菌纲。研究表明,春秋两季刺参肠道内菌群结构呈现类似的演替变化规律,α-变形菌纲所占比例下降,而γ-变形菌纲与黄杆菌纲所占比例上升。     

厌氧氨氧化反应器载体生物膜细菌多样性的研究

采用细菌16S rRNA通用引物1055F/1392R-GC获得的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),分析了两个厌氧氨氧化反应器在不同运行时间其载体生物膜上的细菌多样性。结果表明,两个反应器在不同运行时间其细菌种群多样性有一定差异。DGGE优势条带序列系统发育分析结果表明,反应器载体生物膜上的细菌类群主要是陶厄氏菌属Thauera、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas,外硫红螺旋菌科Ectothiorho-dospiraceae、酸杆菌门Chloroflexi、绿弯菌门Acidobacteria及不可培养细菌。当反应器运行208 d时,水体中氨氮和亚硝态氮的去除率维持较高水平,两者去除率之比为1.1,表明反应器内发生了厌氧氨氧化反应。针对厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因引物Pla46F/Amx368R-GC获得的PCR产物,采用DGGE技术对载体生物膜上的厌氧氨氧化细菌进行了检测。DGGE优势条带序列分析结果表明,在反应器中富集得到的厌氧氨氧化细菌分别与Planctomycete KSU-1、Candidatus Jettenia asiatica的相似性均为96%,可以认为它们是反应器内起厌氧氨氧化作用的主要细菌。     

洛阳市区猪源肉孢子虫调查及分子病原鉴定

为了了解市售猪肉中肉孢子虫(Sarcocystis)的感染情况和病原种类,随机采集164份洛阳市区不同超市和菜市场销售的新鲜猪瘦肉,利用直接压片镜检法进行肉孢子虫包囊的初步观察。提取包囊阳性肉样的基因组DNA,用基于18S rRNA序列的肉孢子虫属特异性引物,对阳性样品基因组DNA进行巢式聚合酶链反应(PCR)扩增和序列分析。分析结果表明:所采集的164份样品中,镜检肉孢子虫包囊阳性44份,总检出率为26.8%,多为轻度或中度感染。肌肉中包囊呈棒状或梭形,大小为(367~1 976)μm×(176~246)μm。镜检阳性样品用巢式PCR进一步鉴定,均为阳性。从中挑取阳性样品21份测序,所测得14份样品的18S rRNA序列与Gen Bank数据库中米氏肉孢子虫(S.miescheriana)序列相似度最高,达99%以上。说明洛阳市区市售猪肉中肉孢子虫感染率高,感染主要虫种为米氏肉孢子虫。     

DE氧化沟工艺微生物群落结构及其动态变化研究

为了研究DE氧化沟工艺中微生物群落结构及其动态变化,分别从DE氧化沟工艺中好氧区、缺氧区、厌氧区取活性污泥,通过细胞裂解直接提取颗粒污泥细菌基因组DNA。通过PCR-DGGE技术对DE氧化沟工艺中的微生物多样性进行分析,以细菌和古细菌16srRNA基因通用引物530F/1490R对DE氧化沟活性污泥中提取的细菌基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物经纯化后用于变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析。结果显示,DE氧化沟工艺中活性污泥的微生物群落非常丰富,在好氧区微生物的种属达到12种,缺氧区为16种,厌氧区为14种;DE氧化沟工艺不同单元都有一些各自的特有种属和共有种属,工艺中的微生物群落演替不明显,微生物群落相似性为64.7%,群落结构较为稳定。     

中国蛤蜊和四角蛤蜊对干露和淡水浸泡的耐受性比较

为确定中国蛤蜊Mactra chinensis和四角蛤蜊Mactra veneriformis的最佳运输时间及放养方式,在实验室条件下分别进行了其稚贝与成贝对干露和淡水浸泡的耐受性研究。结果表明:1)在试验范围内,中国蛤蜊和四角蛤蜊的死亡率随干露时间的延长呈直线增加(P<0.05);气温为25℃时,中国蛤蜊稚贝耐干露的LT90、LT50和LT10依次为26.4、20.4、14.4 h,四角蛤蜊稚贝的依次为29.2、21.9、14.6 h;气温为15℃时,中国蛤蜊成贝耐干露的LT90、LT50和LT10依次为53.2、35.8、18.3 h,四角蛤蜊成贝的依次为124.6、95.7、66.8 h。2)在试验范围内,中国蛤蜊和四角蛤蜊的死亡率随淡水浸泡时间的延长呈直线增加(P<0.05);中国蛤蜊稚贝耐淡水浸泡的LT90、LT50和LT10依次为9.0、6.6、4.2 h,四角蛤蜊稚贝的依次为15.3、10.8、6.4 h;中国蛤蜊成贝耐淡水浸泡的LT90、LT50和LT10依次为29.4、17.0、4.6 h,四角蛤蜊成贝的依次为52.3、28.9、5.6 h。本研究表明,四角蛤蜊耐干露和淡水浸泡能力总体上要强于中国蛤蜊。     

基于高通量测序分析海带表面细菌群落结构

为研究大连登沙河湾和正明寺海带养殖区海带Saccharina japonica表面及其周围海域海水的细菌群落结构,分别于2015年1月、2月和4月,采用Illumina Miseq PE300高通量测序平台对样本基因组DNA的16S r RNA基因V3~V4区PCR扩增片段进行测序分析。结果表明:从两个海区健康海带和海水中获得优化序列分别为130 158条和124 658条,海带序列可归为8个门和99个属,海水序列可归为14个门和135个属;在门水平,海带首要优势门为厚壁菌门(>69%),其次为变形菌门、蓝细菌门、放线菌门和拟杆菌门(>1%),海水首要优势门为变形菌门(>46%),其次为厚壁菌门、拟杆菌门、蓝细菌门和放线菌门(>1%);在属水平,海带主要优势属为乳球菌属(>40%)和芽孢杆菌属(>10%),其次为Solibacillus、假单胞菌属和节杆菌属(>3%),海水首要优势属为弧菌属(21.58%)和乳球菌属(28.29%),其次为科尔韦尔氏菌属、弓形杆菌属和亚硫酸杆菌属(>2%)。研究表明,两个海区海带细菌群落组成相似,海带和海水细菌群落组成则明显不同。     

岩扇贝原种和繁育后代肠道和内脏团细菌多样性分析

为研究岩扇贝Crassadoma gigantean的生物学特性和消化代谢机能,采用传统培养方法分离培养加拿大原种岩扇贝内脏团(JN)和肠道(JC)及中国育种得到的子一代岩扇贝内脏团(YN)和肠道(YC)4种样品中的细菌,测定分离到的可培养细菌的16S rRNA基因并确定其分类地位;提取上述样品中的总DNA,运用Ion S5~(TM)XL高通量测序平台,对样品中细菌群落多样性进行分析。结果表明:用传统方法获得可培养菌株83株,选取代表菌31株测序并比对,其分别属于嗜冷杆菌属Psychrobacter、动性球菌属Planococcus、弧菌属Vibrio、假单胞菌属Pseudomonas、假交替单胞菌属Pseudoalteromonas、芽孢杆菌属Bacillus、库克菌属Kocuria和副球菌属Paracoccus;高通量测序结果显示,4种样品中有效序列群落结构可分为9个门,分别为变形菌门Proteobacteria、异常球菌-栖热菌门Deinococcus-Thermus、拟杆菌门Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicutes、蓝细菌门Cyanobacteria、软壁菌门Tenericutes、放线菌门Actinobacteria、浮霉菌门Planctomycetes和疣微菌门Verrucomicrobia;加拿大原种岩扇贝肠道样品中的优势菌门为变形菌门(占80%),次优势菌门为拟杆菌门(占15%),内脏团样品中的优势菌门为变形菌门(占52%),次优势门为拟杆菌门(占18%);中国育种得到的子一代岩扇贝肠道样品中的优势菌门为变形菌门(占61%),次优势菌门为拟杆菌门(占26%),内脏团样品中的优势菌门为变形菌门(占73%),次优势菌门为拟杆菌门(占17%)。研究表明,岩扇贝的肠道和内脏团微生物具有丰富的多样性,加拿大原种岩扇贝和国内子一代岩扇贝的肠道和内脏团细菌群落结构存在一定差异。     

岩扇贝原种和繁育后代肠道和内脏团细菌多样性分析

为研究岩扇贝Crassadoma gigantean的生物学特性和消化代谢机能,采用传统培养方法分离培养加拿大原种岩扇贝内脏团(JN)和肠道(JC)及中国育种得到的子一代岩扇贝内脏团(YN)和肠道(YC)4种样品中的细菌,测定分离到的可培养细菌的16S rRNA基因并确定其分类地位;提取上述样品中的总DNA,运用Ion S5^(TM)XL高通量测序平台,对样品中细菌群落多样性进行分析。结果表明:用传统方法获得可培养菌株83株,选取代表菌31株测序并比对,其分别属于嗜冷杆菌属Psychrobacter、动性球菌属Planococcus、弧菌属Vibrio、假单胞菌属Pseudomonas、假交替单胞菌属Pseudoalteromonas、芽孢杆菌属Bacillus、库克菌属Kocuria和副球菌属Paracoccus;高通量测序结果显示,4种样品中有效序列群落结构可分为9个门,分别为变形菌门Proteobacteria、异常球菌-栖热菌门Deinococcus-Thermus、拟杆菌门Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicutes、蓝细菌门Cyanobacteria、软壁菌门Tenericutes、放线菌门Actinobacteria、浮霉菌门Planctomycetes和疣微菌门Verrucomicrobia;加拿大原种岩扇贝肠道样品中的优势菌门为变形菌门(占80%),次优势菌门为拟杆菌门(占15%),内脏团样品中的优势菌门为变形菌门(占52%),次优势门为拟杆菌门(占18%);中国育种得到的子一代岩扇贝肠道样品中的优势菌门为变形菌门(占61%),次优势菌门为拟杆菌门(占26%),内脏团样品中的优势菌门为变形菌门(占73%),次优势菌门为拟杆菌门(占17%)。研究表明,岩扇贝的肠道和内脏团微生物具有丰富的多样性,加拿大原种岩扇贝和国内子一代岩扇贝的肠道和内脏团细菌群落结构存在一定差异。     

BAC滤池应对小分子醛类污染物过程中生物菌落特性变化分析

本文在实验室条件下提取BAC滤池处理乙醛、丙烯醛等小分子醛类污染物前（SC）后（SY）活性炭表面微生物总DNA,构建16S r DNA克隆文库,并通过16S r DNA序列的系统发育分析,对样品中细菌种群多样性及群落结构的前后变化进行了分析。结果表明BAC滤池处理乙醛和丙烯醛前后细菌种群和菌落结构发生了显著变化。SC样品文库中阳性克隆的16S r DNA序列分属13个细菌类群, Alphaproteobacteria（25%）、Acidobacteria（15%）、Planctomycetes（12%）、Betaproteobacteria（11%）、Nitrospira（6%）是其中可辨识的最大几个类群,HPC量为1.18×107 CFU/g;而SY样品阳性克隆的16S r DNA序列分属6个细菌类群,分别为Alphaproteobacteria（10%）、Betaproteobacteria（78%）、 Gammaproteobacteria（5%）、Deltaproteobacteria（5%）、Acidobacteria（1%）、Unidentified bacteria（1%）,HPC量增加到了1.28×108 CFU/g。SY样品文库中与已培养种或克隆相似度较高的种群数为33种,远低于SC样品的81种,且主要菌群丰度增高显著。SY文库中属于Betaproteobacteria类群的SY-10.SY-41.SY-1.SY-75.SY-14.SY-107超过总基因库频率的50%,对乙醛和丙烯醛等小分子醛类的降解起决定性作用。