大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织原代培养的研究

应用组织块培养法,研究了大泷六线鱼Hexagrammos otakii鳍、吻端和肾脏细胞在含有体积分数为20%胎牛血清(FBS)的L-15、DMEM和DMEM/F12 3种培养基中的生长情况,以及人碱性成纤维细胞(bFGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样(IGF-Ⅰ)3种生长因子对细胞贴壁率和迁出率的影响。结果表明:大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏细胞适宜的体外培养体系为DMEM/F12培养基+20%FBS,pH为7.2,温度为25℃;在最适培养基中分别添加5.0 ng/mL bFGF、20μg/mL硫酸软骨素、40 ng/mL IGF-Ⅰ时,3种组织的贴壁率和细胞迁出率均最高;鳍、吻端和肾脏组织分别经培养21、15、18 d后长满单层,主要为成纤维样细胞;采用低渗滴片法制备染色体,3种组织原代细胞的染色体数目为48条。本研究为大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织细胞系的构建和生物学特性的研究奠定了基础。     

红鳍东方鲀白介素15的原核表达及其活性测定

为了开发红鳍东方鲀Takifugu rubripes免疫基因及其重组表达,生产重组免疫因子蛋白,通过提取红鳍东方鲀肾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到白介素15(interleukin15,IL15)基因序列,将IL15成熟肽序列与原核表达载体p ET-32a(+)连接,成功构建重组表达载体(重组子)p ET-32a(+)-IL15,并将其重组子转化至Escheria coli BL21(DE3)感受态细胞中获得重组表达IL15的基因工程菌,再经IPTG诱导,p ET-32a(+)-IL15在BL21中得到了融合表达。结果表明:通过对表达产物的纯化和Western Blotting检测,红鳍东方鲀IL15在大肠杆菌中的表达量较高,蛋白浓度为294.6μg/m L;用MTT法对该蛋白进行活性鉴定显示,加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲀IL15蛋白时,CTLL-2细胞的增殖率相对较高,分别为71%和73%。研究表明,重组红鳍东方鲀IL15蛋白具有体外促进CTLL-2细胞增值的能力。     

红鳍东方鲀白介素15的原核表达及其活性测定

为了开发红鳍东方鲀Takifugu rubripes免疫基因及其重组表达,生产重组免疫因子蛋白,通过提取红鳍东方鲀肾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到白介素15(interleukin15,IL15)基因序列,将IL15成熟肽序列与原核表达载体p ET-32a(+)连接,成功构建重组表达载体(重组子)p ET-32a(+)-IL15,并将其重组子转化至Escheria coli BL21(DE3)感受态细胞中获得重组表达IL15的基因工程菌,再经IPTG诱导,p ET-32a(+)-IL15在BL21中得到了融合表达。结果表明:通过对表达产物的纯化和Western Blotting检测,红鳍东方鲀IL15在大肠杆菌中的表达量较高,蛋白浓度为294.6μg/m L;用MTT法对该蛋白进行活性鉴定显示,加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲀IL15蛋白时,CTLL-2细胞的增殖率相对较高,分别为71%和73%。研究表明,重组红鳍东方鲀IL15蛋白具有体外促进CTLL-2细胞增值的能力。     

消油剂对红鳍东方鲀幼鱼的急性毒性效应

在水温为(21.0±0.5)℃、盐度为32的条件下,研究了消油剂和原油-消油剂混合液对红鳍东方鲀Takifugu rubripes幼鱼(体质量为2.73 g±0.66 g)的急性毒性效应。结果表明:在96 h之内,随试验时间(t)的延长,消油剂对红鳍东方鲀的半致死浓度(LC50)逐渐降低,二者呈幂函数关系,其关系式为LC50=9452.2t-0.9529(R2=0.8794);原油-消油剂混合液对红鳍东方鲀的LC50也随试验时间的延长逐渐降低,二者呈线性函数关系,其关系式为LC50=-0.0303t+11.244(R2=0.891);消油剂和原油-消油剂混合液对红鳍东方鲀的96 h LC50分别为146.41、8.45 mg/L,表明原油-消油剂混合液对红鳍东方鲀的生物毒性大于消油剂,消油剂对红鳍东方鲀的生物毒性为一般毒性,而原油-消油剂混合液为高毒性;红鳍东方鲀中毒症状表现为在水面缓慢游动,有时失去平衡,身体侧翻,最后沉卧于水底死亡;死亡的红鳍东方鲀表现为鳃丝充血肿胀,鳃和体表的黏液分泌增加,体表腐烂发白。     

海水中大量培养西藏拟溞及作为红鳍东方鲀鱼苗活饵料的研究

为了给北方海水鱼虾蟹苗提供一种新的活饵料,在海水中进行了大量培养西藏拟溞Daphniopsistibetana和将该溞投喂红鳍东方鲀Fugu rubripes的试验。结果表明:西藏拟溞培育的最高密度为1 570² 320个/L,平均日产量为23.02 320个/L,平均日产量为23.0³5.2 g/(m3.d);摄食西藏拟溞的红鳍东方鲀的存活率、体长和体重相对增长率与对照组差异不显著(P>0.05),饵料系数高于对照组,而日粮却与对照组接近;摄食西藏拟溞的红鳍东方鲀鱼体的高度不饱和脂肪酸(HUFA)中,除C22∶6ω3(DHA)的含量低于对照组外,其余脂肪酸的含量均高于或与对照组相当。同时也讨论了影响西藏拟溞密度和产量的生态因子及西藏拟溞的营养价值问题。     

饥饿对红鳍东方鲀免疫细胞功能的影响

对红鳍东方鲀Fugu rubripes进行正常投喂和饥饿处理(10、20、30、40 d)后,测定红鳍东方鲀外周血中白细胞数量以及脾脏中淋巴细胞的转化率和巨噬细胞的吞噬率。结果表明:饥饿后红鳍东方鲀外周血中白细胞的数量明显高于正常投喂组,且在饥饿20 d时白细胞的数量达到最大值;饥饿后脾脏中淋巴细胞的增殖转化能力与转化率比正常投喂组高,饥饿10 d时达到最大值,随着饥饿时间的延长,淋巴细胞的转化率逐渐降低;饥饿后脾脏中巨噬细胞的吞噬活性与吞噬率均高于正常投喂组,且在饥饿20 d时达到最大值。     

光周期对红鳍东方鲀脑组织中GH和SS基因表达水平和昼夜表达模式的影响

为研究光周期对红鳍东方鲀Takifugu rubripes脑组织中生长激素(Growth hormone,GH)基因、生长激素抑制素(Somatostatin,SS)基因表达水平和昼夜表达模式的影响,采用初始体质量为(7.89±0.42)g的红鳍东方鲀幼鱼为研究对象,养殖在试验桶(直径80 cm、深50 cm)中,海水温度为19～23℃,盐度为31～32,共设置5种光周期8L∶16D、12L∶12D、16L∶8D、20L∶4D、24L∶0D,每个处理组设3个平行,每桶放60尾鱼,试验周期为30 d,试验结束后全天取样,测定脑组织中GH、SS基因表达水平。结果表明:8L∶16D光周期处理组红鳍东方鲀脑组织中GH基因相对表达量显著高于其他光周期处理组(P<0.05);8L∶16D光周期处理组SS基因相对表达量显著高于24L∶0D组(P<0.05),其他处理组SS基因相对表达量无显著性差异(P>0.05);GH和SS基因表达水平分别在12L∶12D和8L∶16D光照条件下呈现昼低夜高的特点。研究表明,结合GH和SS基因在不同光周期下的表达量及昼夜表达特点,长时间光照(16～24 h/d)并不利于红鳍东方鲀幼鱼生理节律的维持,本试验条件下最佳光照时长为8～12 h/d。     

温度对不同体质量红鳍东方鲀幼鱼耗氧率和排氨率的影响

在实验室条件下,进行了3种温度(15、20、25℃)对体质量分别为(23.9±2.0)、(30.1±1.5)、(43.8±1.6)g的红鳍东方鲀Takifugu rubripes幼鱼呼吸和代谢的影响试验。结果表明:在温度为15²5℃时,红鳍东方鲀幼鱼的耗氧率(RO)和排氨率(RN)均随着温度的升高而增大,RO和RN与温度(T)之间的关系符合指数函数关系;红鳍东方鲀幼鱼的耗氧率和排氨率均随着鱼体质量的增加而减少,RO和RN与体质量(W)之间的关系符合幂函数关系;红鳍东方鲀幼鱼的O/N值随温度的升高而降低,随体质量的增加而升高。研究表明,在试验温度范围内,红鳍东方鲀幼鱼对温度的敏感性相对较弱,温度变化对其代谢的影响较小,且红鳍东方鲀幼鱼摄取的主要能源物质是蛋白质。     

壳寡糖对红鳍东方鲀血液指标和非特异性免疫指标的影响

为研究壳寡糖(chitosan-oligosaccbarides,COS)对红鳍东方鲀Takifugu rubripes血清和血液生化指标及非特异性免疫指标的影响,选用体质量为(129.2±3.1)g的红鳍东方鲀600尾,随机分为C0、C1、C2、C3 4组,每组设3个平行,在基础饲料中分别添加0、500、1000、2000 mg/kg的壳寡糖,经56 d饲养后,测定其血液指标、抗氧化酶活性及其攻毒耐受性。结果表明:饲料中添加壳寡糖能显著提高血清中碱性磷酸酶、溶菌酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力和全血中血小板数量(P<0.05),各项指标随壳寡糖添加量的增加整体呈升高趋势;饲料中添加壳寡糖能显著提高红鳍东方鲀肝脏组织中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力(P<0.05),显著降低丙二醛含量(P<0.05);壳寡糖能明显提高红鳍东方鲀对迟缓爱德华氏菌和哈维弧菌的抵抗力。研究表明,在本试验条件下,饲料中添加2000 mg/kg壳寡糖能够提高红鳍东方鲀的非特异性免疫功能。     

壳寡糖对红鳍东方鲀血液指标和非特异性免疫指标的影响

为研究壳寡糖(chitosan-oligosaccbarides,COS)对红鳍东方鲀Takifugu rubripes血清和血液生化指标及非特异性免疫指标的影响,选用体质量为(129.2±3.1)g的红鳍东方鲀600尾,随机分为C0、C1、C2、C3 4组,每组设3个平行,在基础饲料中分别添加0、500、1000、2000 mg/kg的壳寡糖,经56 d饲养后,测定其血液指标、抗氧化酶活性及其攻毒耐受性。结果表明:饲料中添加壳寡糖能显著提高血清中碱性磷酸酶、溶菌酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力和全血中血小板数量(P<0.05),各项指标随壳寡糖添加量的增加整体呈升高趋势;饲料中添加壳寡糖能显著提高红鳍东方鲀肝脏组织中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力(P<0.05),显著降低丙二醛含量(P<0.05);壳寡糖能明显提高红鳍东方鲀对迟缓爱德华氏菌和哈维弧菌的抵抗力。研究表明,在本试验条件下,饲料中添加2000 mg/kg壳寡糖能够提高红鳍东方鲀的非特异性免疫功能。