用16S rDNA克隆文库法分析患病刺参幼苗的菌群结构

采用16S rDNA克隆文库法对某刺参养殖场患病刺参Apostichopus japonicus幼苗(体长为3⁵ cm)表皮的菌群结构进行分析。结果表明:化皮参苗病灶组织和未明显化皮参苗表皮菌群均由γ-变形菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲组成,优势菌为γ-变形菌纲,主要包括志贺氏菌Shigella sp.、不动杆菌Acinetobacter sp.和假单胞菌Pseudomonas sp.;化皮参苗病灶组织中志贺氏菌、不动杆菌和假单胞菌比例分别为49%、17%和5%,未明显化皮参苗表皮中3类菌的比例分别为20%、26%、9%。将该养殖场育苗池海水作为对照并进行菌群结构分析,结果显示,水中菌群同样由γ-变形菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲组成,优势菌也为γ-变形菌纲,主要包含弧菌Vibrio sp.(75%)与志贺氏菌(12%)。此外,对化皮参苗病灶处进行细菌分离培养,得到一株优势菌,经16S rDNA初步鉴定为弧菌。研究表明,采用16S rDNA克隆文库法所得结果与传统的病原分离培养法存在差异。     

黄、渤海春季刺参肠道及养殖池塘细菌菌群的多样性

以黄海和渤海春季刺参养殖池塘的沉积物、海水和刺参Apostichopus japonicus肠道内容物中的细菌基因组DNA为模板,以细菌16S r DNA通用引物进行PCR扩增,构建16S r DNA文库并进行测序分析。结果表明:黄海和渤海养殖刺参肠道内容物、池塘沉积物和海水中共存在变形菌Proteobacteria、蓝细菌门Cyanobacteria、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes和厚壁菌门Firmicutes 5个门类的细菌类群,其优势类群均为变形菌(变形菌比例>41%),且在文库所含变形菌的4个亚门(Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria)中,除黄海春季刺参养殖池塘海水文库(YSp3)中α-变形菌占优势外,其余5个文库均以γ-变形菌为优势亚门。     

秋、冬季刺参养殖池塘菌群的多样性分析

以黄海和渤海代表性刺参养殖池塘秋、冬季海水和沉积物基因组DNA为模板,以细菌16S r DNA通用引物进行PCR扩增,构建16S r DNA文库并进行测序分析,研究了秋、冬季刺参养殖池塘菌群的多样性。结果表明:海水和沉积物中主要包括11个门类的细菌,即变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、绿弯菌门(Chloroflexi);黄海和渤海刺参养殖池塘海水和沉积物中优势类群均为变形菌(变形菌比例>48%);用Shannon指数及Simpson优势度指数分析细菌的多样性,黄、渤海刺参养殖池塘中,冬季沉积物细菌Simpson优势度指数均最低,分别为0.014 89和0.016 50,Shannon指数均最高,分别为6.312和5.695。研究表明,黄海和渤海刺参养殖池塘中,冬季沉积物细菌多样性均最高。     

斜带石斑鱼幼鱼消化道与养殖水体中可培养菌群的研究

利用海水琼脂、TCBS和MRS培养基对斜带石斑鱼Epinephelus coioides幼鱼消化道和养殖水体中的细菌进行分离纯化,采用生理生化鉴定结合16S rRNA基因测序进行细菌鉴定,探讨了幼鱼消化道中的菌群与养殖水体中菌群的关系。结果表明:幼鱼消化道中可培养细菌总数(9.0×106cfu/g)高于养殖水体中可培养细菌总数(5.4×105cfu/mL),幼鱼消化道中细菌种类也明显多于养殖水体;在幼鱼消化道和养殖水体中均检测到副溶血弧菌、哈维氏弧菌、短小芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、鲍氏不动杆菌、嗜冷杆菌和洋葱伯克霍尔德菌等7种细菌。细菌系统进化分析结果表明,这些细菌隶属于β-变形杆菌纲、γ-变形杆菌纲和芽孢杆菌纲。幼鱼消化道和养殖水体的优势菌中均有芽孢杆菌和嗜冷杆菌,提示芽孢杆菌和嗜冷杆菌能通过养殖水体很好地进入消化道。3种乳酸菌(乳酸乳球菌、干酪乳杆菌和屎肠球菌)仅见于幼鱼消化道,且仅占消化道菌群数量的0.70%。弧菌在消化道和养殖水体中所占比例均很小,分别仅占细菌总数的1.07%和0.10%。     

土池和高位铺膜池养殖杂交鳢肠道菌群结构的比较分析

为研究土池和高位铺膜池两种养殖模式下杂交鳢Channa maculata♀×Channa maculata argus♂肠道菌群结构的差异,采用高通量测序方法分别对土池养殖的健康杂交鳢(体质量为1 140.67 g±45.88 g)和高位铺膜池养殖的健康杂交鳢(体质量为1 130.00 g±96.27 g)肠道菌群结构进行了对比分析,其中,土池设置3个重复组,分别记为abce123、abce124和abce125,高位铺膜池设置3个重复组,分别记为abce126、abce127和abce128。结果表明:高位铺膜池的水温、pH与土池无显著性差异,但总氨氮、亚硝酸氮和总碱度等明显低于土池;不同养殖模式下杂交鳢肠道菌群结构存在明显差异,且土池养殖杂交鳢肠道中细菌多样性远高于高位铺膜池;在门水平上,土池杂交鳢肠道样品abce123中变形菌门所占比例明显高于其他门类,样品abce124、abce125中分别以变形菌门Proteobacteria和拟杆菌门Bacteroidetes所占比例最高,而高位铺膜池3个肠道样品中均以梭杆菌门Fusobacteria所占比例最高;在属水平上,土池abce123肠道样品中优势细菌属类均为未知细菌属类,abce124肠道样品中优势细菌属类按丰度依次为金黄杆菌属Chryseobacterium、支原体属Mycoplasma、食酸菌属Acidovorax、不动杆菌属Acinetobacter和鲸杆菌属Cetobacterium,abce125肠道样品中优势细菌属类按丰度依次为金黄杆菌属、不动杆菌属、食酸菌属、支原体属和鲸杆菌属,而高位铺膜池3个样品中均以鲸杆菌属为主,占95%以上。研究表明,土池和高位铺膜池两种不同养殖模式下杂交鳢肠道微生物组成及多样性差异较大,其结果可为今后杂交鳢的养殖模式选择和微生态学研究提供数据参考。     

3种水质调控方式下春季参池环境及刺参肠道的细菌群落结构

为研究养水机在调控刺参Apostichopus japonicus池塘水质中的作用,通过16S rDNA高通量测序方法研究了养水机(功率750 W)、自然纳潮、微孔曝气3种水质调控方式下春季刺参池塘环境及刺参肠道菌群结构。结果表明:参池水样、沉积物和刺参肠道中共含有变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、疣微菌门Verrucomicrobia、厚壁菌门Firmicutes、浮霉菌门Planctomycetes、放线菌门Actinocteria、蓝细菌门Cyanobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、酸杆菌门Acidobacteria、芽单胞菌门Gemmatimonadetes;仅微孔曝气参池水样中第一优势菌为拟杆菌门(61.9%),微孔曝气参池沉积物、刺参肠道及其他参池水样、沉积物、刺参肠道中第一优势菌均为变形菌门(≥55.9%);养水机参池水样和沉积物中Simpson优势度指数最低,Chao1、ACE、Shannon指数均最高,该池刺参肠道中ACE、Shannon指数均最高。研究表明,养水机有利于池塘环境中的细菌多样性和刺参肠道细菌多样性。     

3种水质调控方式下春季参池环境及刺参肠道的细菌群落结构

为研究养水机在调控刺参Apostichopus japonicus池塘水质中的作用,通过16S rDNA高通量测序方法研究了养水机(功率750 W)、自然纳潮、微孔曝气3种水质调控方式下春季刺参池塘环境及刺参肠道菌群结构。结果表明:参池水样、沉积物和刺参肠道中共含有变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、疣微菌门Verrucomicrobia、厚壁菌门Firmicutes、浮霉菌门Planctomycetes、放线菌门Actinocteria、蓝细菌门Cyanobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、酸杆菌门Acidobacteria、芽单胞菌门Gemmatimonadetes;仅微孔曝气参池水样中第一优势菌为拟杆菌门(61.9%),微孔曝气参池沉积物、刺参肠道及其他参池水样、沉积物、刺参肠道中第一优势菌均为变形菌门(≥55.9%);养水机参池水样和沉积物中Simpson优势度指数最低,Chao1、ACE、Shannon指数均最高,该池刺参肠道中ACE、Shannon指数均最高。研究表明,养水机有利于池塘环境中的细菌多样性和刺参肠道细菌多样性。     

不同生长速度的大黄鱼肠道菌群结构的差异

为分析肠道菌群结构变化对大黄鱼Pseudosciaena crocea生长速度的影响,采用高通量测序的方法,对生长条件相同、生长速度不同的两组大黄鱼肠道菌群结构进行了研究。结果表明:生长缓慢组鱼肠道内菌群OTUs和菌群多样性指数Chao1显著高于生长正常组(P<0.05),但两组间Shannon指数差异不显著(P>0.05);变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、梭杆菌门Fusobacteria和拟杆菌门Bacteroidetes为大黄鱼肠道内的优势菌群,其中变形菌门在两组鱼肠道内的相对丰度超过50%;两组大黄鱼肠道菌群结构变化主要集中在变形菌门、放线菌门Actinobacteria和蓝细菌门Cyanobacteria;科水平上的细菌相对丰度比较结果显示,变形菌门内的鞘脂单胞菌科Sphingomonadaceae、柄杆菌科Caulobacteraceae、丛毛单胞菌科Comamonadaceae、假单胞菌科Pseudomonadaceae和莫拉氏菌科Moraxellaceae在两组鱼肠道内的相对丰度差异显著(P<0.05),其中莫拉氏菌科在生长缓慢组鱼肠道内的含量显著高于生长正常组(P<0.05)。研究表明,不同生长速度的大黄鱼肠道菌群结构存在差异,生长缓慢组鱼肠道内菌群种类多于生长正常组;变形菌门内菌群变化与大黄鱼生长密切相关,莫拉氏菌科在鱼肠道内含量的变化可能是引起大黄鱼生长变慢的主要原因。     

不同生长速度的大黄鱼肠道菌群结构的差异

为分析肠道菌群结构变化对大黄鱼Pseudosciaena crocea生长速度的影响,采用高通量测序的方法,对生长条件相同、生长速度不同的两组大黄鱼肠道菌群结构进行了研究。结果表明:生长缓慢组鱼肠道内菌群OTUs和菌群多样性指数Chao1显著高于生长正常组(P<0.05),但两组间Shannon指数差异不显著(P>0.05);变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、梭杆菌门Fusobacteria和拟杆菌门Bacteroidetes为大黄鱼肠道内的优势菌群,其中变形菌门在两组鱼肠道内的相对丰度超过50%;两组大黄鱼肠道菌群结构变化主要集中在变形菌门、放线菌门Actinobacteria和蓝细菌门Cyanobacteria;科水平上的细菌相对丰度比较结果显示,变形菌门内的鞘脂单胞菌科Sphingomonadaceae、柄杆菌科Caulobacteraceae、丛毛单胞菌科Comamonadaceae、假单胞菌科Pseudomonadaceae和莫拉氏菌科Moraxellaceae在两组鱼肠道内的相对丰度差异显著(P<0.05),其中莫拉氏菌科在生长缓慢组鱼肠道内的含量显著高于生长正常组(P<0.05)。研究表明,不同生长速度的大黄鱼肠道菌群结构存在差异,生长缓慢组鱼肠道内菌群种类多于生长正常组;变形菌门内菌群变化与大黄鱼生长密切相关,莫拉氏菌科在鱼肠道内含量的变化可能是引起大黄鱼生长变慢的主要原因。     

饲料中添加壳寡糖对刺参肠壁菌群的影响

为研究饲料中添加壳寡糖对刺参Apostichopus japonicus肠壁菌群的影响,在刺参基础饲料中分别添加0.25%(G1)、0.50%(G2)、0.75%(G3)和1.00%(G4)的壳寡糖,另设对照组(G0),养殖50 d后采集各组刺参幼参(5.03 g±0.03 g)肠壁样品,并采用高通量测序技术分析刺参肠壁菌群结构特征。结果表明:壳寡糖添加组刺参肠壁的细菌多样性和丰度均高于对照组;各组样品肠壁优势菌门均为变形菌门和厚壁菌门;壳寡糖对刺参肠壁菌群组成产生了明显影响,对照组优势菌属为希瓦氏菌属Shewanella,而壳寡糖添加组希瓦氏菌属的相对比例均下降,对照组芽孢杆菌属Bacillus的相对比例较低,而壳寡糖添加组芽孢杆菌属的相对比例均较高或成为优势菌属;1.00%壳寡糖组各类菌属相对比例均较低,高浓度壳寡糖出现抑制现象。研究表明,饲料中添加壳寡糖可提高刺参肠壁细菌多样性和丰度,明显改善刺参肠壁菌群结构。