狼毒多糖对TNF-α诱导的内皮细胞P-selectin表达的影响

目的:探讨狼毒多糖(EFP-AW1)对TNF-α诱导的内皮细胞P-selectin表达的影响。方法:以TNF-α诱导HUVECs建立内皮细胞分泌P-selectin模型,流式细胞术检测EFP-AW1对TNF-α诱导的HUVECs细胞P-selectin蛋白表达的影响;Real-time PCR检测EFP-AW1对TNF-α诱导的HUVECs细胞P-selectin m RNA表达的影响。结果:HUVECs经TNF-α刺激后P-selectin表达较空白对照组明显增强(P<0.05),而经过EFP-AW1预处理的HUVECs P-selectin m RNA和蛋白表达水平与TNF-α刺激组比较明显降低(P<0.05),并具有一定的剂量依赖性。结论:EFP-AW1能够降低TNF-α诱导的内皮细胞黏附分子P-selectin表达,从而抑制P-selectin介导的肿瘤细胞与内皮细胞的黏附。     

草鱼呼肠孤病毒VP5蛋白的表达与纯化

从草鱼Ctenopharyngodon idellus出血病病原——草鱼呼肠孤病毒GCRV-873株扩增病毒的外壳蛋白(GCRV-VP5)基因,并将GCRV-VP5基因克隆到原核表达载体pET-30α,转化至大肠杆菌E.coli BL-21(DE3)中后,用IPTG诱导培养,获得带有重组质粒菌体的总蛋白。用GCRV-873毒株免疫山羊得到的抗血清作为一抗进行免疫印迹试验,结果在硝酸纤维素膜上检测到在相对分子质量为77 000处有特异性免疫条带,与预测的GCRV-873 VP5蛋白一致,提示大肠杆菌融合表达草鱼出血病病毒的VP5蛋白。表达的融合蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,经柱层析纯化后蛋白纯度可达90%。本试验中获得的融合蛋白可为后期免疫动物提供了抗原,也为建立GCRV免疫学检测方法提供了依据。     

基于密码子优化策略的无乳链球菌表面蛋白LrrG的原核表达、纯化及免疫原性

为高效获得可溶性无乳链球菌表面蛋白(LrrG),通过密码子优化及构建LrrG基因优化后的pCzn1-LrrG重组表达载体,并转染至BL21(Plys)感受态细胞中,高效表达了无乳链球菌Streptococcus agalactiae(GBS)富含亮氨酸重复序列蛋白(LrrG)。根据大肠杆菌密码子偏好性,优化并人工合成LrrG全基因序列,经双酶切后插入至表达载体,将优化后的重组质粒pCzn1-LrrG转染至感受态细胞进行原核表达,经裂解和纯化后获得上清重组蛋白LrrG。结果表明:PCR扩增得到2 286 bp的优化LrrG基因片段,构建的重组质粒pCzn1-LrrG经双酶切获得约4 400 bp和2 286 bp两条片段,与预期值相符;重组载体的测序结果与优化后的基因碱基序列比对结果完全一致,编码的氨基酸序列未发生突变;SDS-PAGE和Western blot鉴定结果显示,获得了相对分子质量约为108 000的LrrG重组蛋白,与理论值相符,且优化后LrrG重组蛋白具有GBS抗原反应原性;通过亲和层析纯化LrrG上清蛋白后,发现优化后可溶性LrrG蛋白表达量较优化前提高了2.2～3.8倍;利用优化后的LrrG蛋白免疫罗非鱼后,发现其对罗非鱼抗GBS感染具有61.54%～69.23%的相对免疫保护率。研究表明,按照大肠杆菌密码子优化GBS表面蛋白LrrG,可有效提高其在大肠杆菌中的表达量,且优化后的LrrG重组蛋白仍然具有较好的免疫原性,本研究结果为基于LrrG基因工程疫苗的制备和应用提供了科学参考。     

幽门螺杆菌BabA蛋白N段的基因克隆、表达纯化及体外粘附活性评价

目的:克隆幽门螺杆菌BabA蛋白的N段(氨基酸1-437位)基因(BabA1),构建其原核表达质粒,表达并纯化获得携带6×His标签的BabA1融合蛋白,评价融合蛋白的体外粘附活性。方法:以幽门螺杆菌J99菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得BabA1基因片段,并定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)。经酶切及测序分析正确后,将重组质粒pET32a-BabA1转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行IPTG诱导表达,并对表达产物进行镍柱纯化、SDS-PAGE和Westernblot鉴定。采用菌落计数法评价BabA1融合蛋白在体外的细胞粘附活性。结果:成功扩增了BabA1基因,构建了pET32a-BabA1原核表达质粒,并通过优化该表达系统的最适诱导和纯化条件,获得了具有活性的6×His-BabA1融合蛋白,后者能显著增强大肠杆菌BL21(DE3)在体外对胃癌MFC细胞的粘附。结论:成功诱导表达并纯化获得了有粘附活性的6×His-BabA1融合蛋白,为进一步研究其免疫活性和生物学功能奠定了基础。     

果蝇Bves蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的为了进一步研究细胞粘附分子Bves在肿瘤的发生及转移过程中的作用,需要获得Bves蛋白并制备其抗体。方法根据Flybase网站所提供的Bves基因序列,以果蝇的总RNA为模板进行PCR扩增,得到Bves部分编码序列,随后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达载体。重组表达质粒经酶切测序鉴定后,转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,并用IPTG诱导融合蛋白的表达,使用活化的Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化后得到的His-Bves融合蛋白免疫注射新西兰大白兔制备Bves多克隆抗体,并用Western blot对抗体效价进行检测。结果和结论获得了Bves原核表达重组融合蛋白及高效价的兔抗Bves多克隆抗体,为后期深入研究Bves基因的功能奠定了基础。     

rhEPO通过调节PI3K/AKT信号通路改善大鼠脑出血后神经元损伤

目的研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)是否可以通过调节PI3K/AKT信号通路来改善大鼠脑出血后的神经元损伤。方法 SD大鼠构建脑出血(ICH)模型,并给予rhEPO药物治疗,采用TUNEL法和试剂盒检测神经细胞凋亡及凋亡蛋白Caspase 9表达;采用Real-Time PCR法和Western blot法检测PI3K、AKT的基因和蛋白磷酸化水平的表达。结果与ICH非治疗组相比,rhEPO治疗组中神经元凋亡细胞数和Caspase 9活性表达明显降低(P<0.05);rhEPO治疗组PI3K和AKT的蛋白磷酸化水平表达和mRNA表达显著升高(P<0.05)。结论重组人促红细胞生成素rhEPO具有神经保护作用,可以通过调节PI3K/AKT信号来改善大鼠脑出血后的神经元损伤。     

棘孢木霉几丁质酶tachi2基因的原核表达及酶学性质研究

目的:实现棘孢木霉(Trichoderma asperellum)几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,研究几丁质酶Tachi2的酶学性质。方法:利用PCR技术扩增得到几丁质酶基因tachi2,将其克隆到原核表达载体pEHISTEV中,测序后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行Tachi2蛋白的纯化和复性。用纯化的目的蛋白Tachi2进行几丁质酶酶学性质的研究。结果:tachi2基因在重组大肠杆菌中正确表达,其主要以包涵体形式存在;重组蛋白Tachi2分子量约为44kDa,经过纯化和复性后得到的Tachi2有较高的几丁质酶活性。该酶的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,几丁质酶在40℃以下比较稳定、pH 6～9时酶有较高活性,受Cu2+和Zn2+的强烈抑制。结论:成功实现了棘孢木霉几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,表达纯化了重组蛋白,明确了几丁质酶Tachi2的酶学性质,为该几丁质酶的进一步开发利用和深入研究奠定了基础。     

斜带石斑鱼热休克蛋白基因HSP70在LPS和Poly I∶C刺激下的表达分析及重组蛋白制备

为了解斜带石斑鱼Epinephelus coioides热休克蛋白(HSP70)基因(EcHSP70,GenBank登录号MW411059)在石斑鱼抗病原感染中的功能,采用荧光定量PCR检测了LPS与Poly I∶C刺激后48 h内,石斑鱼脾脏细胞(GS)中EcHSP70的表达变化;构建重组质粒EcHSP70-4T,转化到BL21(DE3)后进行诱导表达,利用SDS-PAGE电泳和Western blot检测EcHSP70重组蛋白的表达形式。结果表明:LPS与Poly I∶C刺激后,石斑鱼脾脏细胞中EcHSP70基因表达量上调;SDS-PAGE与Western blot检测表明,EcHSP70-4T重组蛋白相对分子质量约为96 000,主要以包涵体形式表达。研究表明,EcHSP70蛋白可能参与了石斑鱼的免疫反应,其在大肠杆菌中能以包涵体形式高效表达,并纯化获得了EcHSP70重组蛋白,本研究结果为鉴定EcHSP70的互作蛋白及进一步了解该蛋白在免疫反应中的作用机制提供了数据参考。     

集成干扰素突变体IIFN/165S的构建及其生物学评价

目的:通过定点突变,构建集成干扰素(IIFN/165S),以期获得高效的新型药物分子。方法:采用PCR体外定点突变技术,使集成干扰素IIFN基因的第165位密码子由CGT突变为AGT。扩增片段克隆入pET-23b表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。在LB培养基中培养,经IPTG诱导表达的IIFN/165S经包涵体变性、复性以及层析纯化后,经SDS-PAGE、Western blot和MALDI-TOF-MS分析,用WISH-VSV系统进行抗病毒活性测定同时应用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:IIFN/165S以包涵体形式表达。纯化后,IIFN/165S的纯度大于95%,分子量为18172,比活性(7.63±0.22)×108IU/mg,诱导细胞凋亡率呈剂量依赖。结论:构建了IIFN/165S的表达载体,并成功地在大肠杆菌中表达,获得了高纯度高活性突变分子IIFN/165S。     

肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0147诱导单核细胞分泌TNF-α和IL-8

目的探讨肺炎嗜衣原体(Cpn)包涵体膜蛋白Cpn0147诱导人单核细胞分泌炎症因子的分子机制。方法用去除内毒素活性的不同浓度Cpn0147重组蛋白(1.0、10.0、30.0和50.0μg/m L)刺激THP-1细胞0~48 h,ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-8(IL-8)的分泌水平;实时定量PCR检测TNF-α和IL-8 m RNA的表达;用Toll样受体2(TLR2)和TLR4中和抗体处理THP-1细胞,或采用TLR2和TLR4 si RNA沉默其表达,ELISA检测THP-1处理前后TNF-α和IL-8分泌的变化。结果 Cpn0147可诱导THP-1细胞表达TNF-α和IL-8的m RNA和蛋白;同时,不同时间点Cpn0147对TNF-α和IL-8的诱导水平有所不同,Cpn0147作用2~6 h后即可诱导TNF-α和IL-8分泌,12 h时达到峰值,随后逐渐下降。采用TLR2和TLR4中和抗体封闭THP-1细胞后,TNF-α和IL-8分泌水平明显减少,采用TLR2和TLR4 si RNA干扰其表达后,TNF-α和IL-8的分泌也得到了类似的结果。结论 Cpn0147可能通过TLR2和TLR4介导TNF-α和IL-8分泌。