不同倍性泥鳅鳍细胞培养及染色体标本制备方法的研究

以天然二倍体、杂交三倍体(4n♀×2n♂)和天然四倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus的鳍组织为材料,对短期培养的消毒方法、秋水仙素的浓度(1.0、1.5、2.0μg/mL)与处理时间(2、3、4 h)和低渗处理时间(30、40、50 min)等细胞培养技术,及染色体标本制备方法进行了研究。结果表明:选择100 g/L的碘伏溶液杀菌效果良好,对于细胞生长影响较小,尤以处理15 min时的效果最明显,细胞迁出迅速;在终止培养前3 h加入秋水仙素至终浓度为1.5μg/mL,天然二倍体、杂交三倍体和天然四倍体泥鳅鳍细胞中期分裂相染色体众数最高,分别为93.33%、90.00%、70.00%;25℃下低渗处理40 min时,可以获得大量图像清晰、长度适中、分散良好、染色体数目完整的染色体中期分裂相。本研究中初步建立了以鳍组织培养法作为材料来源快速制备不同倍性泥鳅染色体标本的方法。     

自然四倍体泥鳅雄核发育二倍体染色体组构成研究

为探究鱼类雄核发育新途径及自然四倍体泥鳅所产生的配子染色体组构成,采用自然四倍体泥鳅(4n=100)为父本、二倍体泥鳅(2n=50)为母本进行杂交,受精后5 min将受精卵放入3℃水中处理60 min诱导雄核发育二倍体泥鳅,并对其后代的血红细胞核体积、染色体核型、Ag-NORs带型及荧光原位杂交(FISH)信号等进行了研究。结果表明:对照组杂交三倍体泥鳅血红细胞核体积为(38.29±3.14)μm³,处理组雄核发育二倍体泥鳅血红细胞核体积为(27.92±3.58)μm3,处理组雄核发育二倍体泥鳅血红细胞核体积为(27.92±3.58)μm³,二者血红细胞核体积之比为1.37∶1;杂交三倍体泥鳅胚胎染色体数目3n=75,核型公式为15m+6sm+54t, NF=96,雄核发育二倍体泥鳅胚胎染色体数目2n=50,核型公式为10m+4sm+36t, NF=64;杂交三倍体泥鳅胚胎染色体中,在3个染色体短臂的端部检测到3个FISH杂交信号,雄核发育二倍体泥鳅胚胎染色体中,在2个染色体短臂的端部检测到2个FISH杂交信号;杂交三倍体泥鳅染色体和间期核中,呈现出Ag-NORs数目为1～3个,雄核发育二倍体泥鳅胚胎染色体和间期核中,呈现出Ag-NORs数目为1～2个。研究表明,雄核发育二倍体泥鳅的染色体组构成为2套染色体组,表明自然四倍体雄性泥鳅能产生二倍体(2n)配子,该结果为自然四倍体雄性泥鳅是具有4套染色体组的遗传四倍体提供了重要的遗传学证据。     

杂交三倍体泥鳅×二倍体泥鳅杂交后代胚胎染色体组构成的研究

为探讨杂交三倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus配子染色体组的构成,以杂交三倍体泥鳅(3n)与二倍体泥鳅(2n)为研究对象,配制2n♀×3n♂和3n♀×2n♂杂交组合,对杂交后代的胚胎染色体进行银染(Ag-NORs)、CMA_3/DA/DAPI三重荧光染色和染色体荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)等方面的研究。结果表明:两个杂交组合的杂交后代胚胎染色体有丝分裂中期分裂相中最高银染点数均为3个,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域;在2n♀×3n♂和3n♀×2n♂杂交后代胚胎染色体有丝分裂中CMA3阳性部位有3个,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域;将核糖体5.8S+28S r DNA定位在杂交后代胚胎染色体上,两种杂交组合均可检测到3簇杂交信号,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域。研究表明,杂交三倍体泥鳅无论雌雄与二倍体泥鳅杂交所产生的后代染色体组构成均为3套染色体组,进而可推测,杂交三倍体泥鳅无论雌雄均可产生(1.5²)n的配子,该结果为三倍体泥鳅配子染色体组成提供了细胞遗传学证据。     

杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系的建立及应用

为研究杂交三倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus的形成机制,探寻其产业化生产的有效途径,通过对GISH的多项试验参数进行优化,建立杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系,并对天然四倍体泥鳅(4n=100)与大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus(2n=48)正、反杂交后代进行GISH分析。结果表明:杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系中,探针DNA在温度为105℃、持续时间为2 min时,片段化后探针DNA片段长度为500~1000 bp;封阻DNA在温度为110℃、持续时间为10 min时,片段长度为100~500bp;标记后的探针DNA与片段化后的封阻DNA混合比(P/B)在1∶25和1∶50时均可以得到较好的杂交信号;以大鳞副泥鳅全基因组DNA为探针DNA、天然四倍体泥鳅全基因组DNA为封阻DNA,与二者正、反交后代进行基因组原位杂交试验,结果显示,来源于亲本大鳞副泥鳅24条染色体在着丝点处均有杂交信号,无杂交信号染色体50条,来源于亲本泥鳅。该研究结果不仅为杂交三倍体泥鳅后代的鉴定提供了最直观的证据,也为中国天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体并能产生2n的配子提供了分子细胞遗传学基础数据,对泥鳅三倍体育种研究具有一定的指导意义。     

杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系的建立及应用

为研究杂交三倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus的形成机制,探寻其产业化生产的有效途径,通过对GISH的多项试验参数进行优化,建立杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系,并对天然四倍体泥鳅(4n=100)与大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus(2n=48)正、反杂交后代进行GISH分析。结果表明:杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系中,探针DNA在温度为105℃、持续时间为2 min时,片段化后探针DNA片段长度为500¹000 bp;封阻DNA在温度为110℃、持续时间为10 min时,片段长度为1001000 bp;封阻DNA在温度为110℃、持续时间为10 min时,片段长度为100⁵00bp;标记后的探针DNA与片段化后的封阻DNA混合比(P/B)在1∶25和1∶50时均可以得到较好的杂交信号;以大鳞副泥鳅全基因组DNA为探针DNA、天然四倍体泥鳅全基因组DNA为封阻DNA,与二者正、反交后代进行基因组原位杂交试验,结果显示,来源于亲本大鳞副泥鳅24条染色体在着丝点处均有杂交信号,无杂交信号染色体50条,来源于亲本泥鳅。该研究结果不仅为杂交三倍体泥鳅后代的鉴定提供了最直观的证据,也为中国天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体并能产生2n的配子提供了分子细胞遗传学基础数据,对泥鳅三倍体育种研究具有一定的指导意义。     

中国洪湖不同倍性泥鳅的染色体组型及形态特征比较分析

以中国洪湖自然二倍体、三倍体、四倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus为研究对象,运用经典的形态测量观察方法、染色体制片技术对不同倍性泥鳅的染色体组型、形态特征进行比较分析。结果表明:1)二倍体泥鳅2n=50,核型公式为10m+4sm+36t,NF=64;三倍体泥鳅3n=75,核型公式为15m+6sm+54t,NF=96;四倍体泥鳅4n=100,核型公式为20m+8sm+72t,NF=128;2)5个比例性状测量结果显示,二倍体与四倍体很接近,没有表现出明显的差异,但两者与三倍体在眼后头长/体长(PL/SL)、后头部到鳃的距离/体长(LOOSR/SL)、背鳍前端到尾鳍的距离/体长(LODO-CB/SL)3个比例性状存在显著差异(P<0.05);3)主成分分析表明,二倍体、三倍体及四倍体形态差异主要系躯体后半部差异所致;(4)聚类分析结果显示,洪湖二倍体和四倍体相聚类,亲缘关系较近,与三倍体群体的聚类关系较远。     

脊尾白虾染色体制备及核型的初步研究

以脊尾白虾Exopalaemon carinicauda原肠胚时期受精卵为材料,采用低渗法和热滴片法制备染色体,对脊尾白虾进行细胞遗传学研究。核型分析结果显示,对50尾脊尾白虾雌虾受精卵中100个良好的中期分裂相进行染色体计数,染色体数目为90的出现频率最高,达到了81%,由此确定脊尾白虾二倍体染色体数目为90,即2n=90;通过对中期分裂相染色体臂长进行测量与分析发现,中部着丝粒染色体(m)共计56条,亚中部着丝粒染色体(sm)共计8条,亚端部着丝粒染色体(st)共计12条,端部着丝粒染色体(t)共计14条,核型组成公式为2n=56m+8sm+12st+14t,没有发现异性性染色体的存在。     

牙鲆单倍体、三倍体、雌核发育二倍体和普通二倍体胚胎发育的比较

在水温为(16.0±0.5)℃、pH为8.0⁸.3、盐度为30.2的条件下,对牙鲆Paralichthys olivaceus单倍体、三倍体和雌核发育二倍体胚胎发育的过程与普通二倍体牙鲆的发育进行了比较。结果表明:单倍体胚胎脊柱弯曲,器官分化不全,受精率低,畸形率高,出膜率低;三倍体和雌核发育二倍体胚胎与普通二倍体牙鲆的发育时序基本相同,受精卵经过卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、卵黄栓胚、克氏囊胚、尾芽胚、心跳胚、出膜期等阶段孵化出膜,各阶段除发育时间不同外,发育特征与发育分期没有明显差别;普通二倍体胚胎约61 h孵化出膜,而三倍体和雌核发育二倍体分别经66 h 30 min和67 h 50 min孵化出膜,孵化时间比普通二倍体牙鲆长约10%。其中,卵裂期三倍体和雌核发育二倍体在细胞分裂阶段发育特别缓慢,发育时间比普通二倍体长约25%。单倍体出膜率为(16.5±2.2)%,畸形率为(97.2±1.6)%;雌核发育二倍体出膜率为(85.6±3.0)%,畸形率为(13.2±2.3)%;三倍体出膜率为(82.3±3.1)%,畸形率为(16.3±2.5)%。与普通二倍体牙鲆相比,三倍体和雌核发育二倍体胚胎出膜率低,仔鱼畸形率高。     

中国鲫与日本鲫几个群体肌浆蛋白的电泳分析

以中国二倍体和三倍体鲫Carassius(黑龙江流域鲫、九江彭泽鲫、宁河彭泽鲫、海河流域鲫、金鱼)以及日本二倍体、三倍体鲫为试验材料,应用水平式淀粉凝胶电泳法对其肌浆蛋白进行了检测分析。结果表明:在中国二倍体鲫中共检测出4种类型(BB、BC、CC和BD),其中BB为主要类型,并且4种类型均不同于日本的二倍体鲫;在中国三倍体鲫中也检测出4种类型(BBB、BBC、BCC、ABB),方正银鲫中的两种类型(BBC、BCC)均不同于九江彭泽鲫、宁河彭泽鲫、于桥水库鲫和日本三倍体鲫,九江彭泽鲫、宁河彭泽鲫以及95.1%的于桥水库鲫为BBB类型,其电泳带组成与谷口顺彦报道的日本银鲫中的Ⅱ-1型相同。     

怀头鲇的核型分析

根据对100个中期分裂相染色体的计数结果,确定怀头鲇Silurus soldatovi的2倍染色体数为2n=58。由所测得的核型参数和Levan等提出的染色体划分标准得出:中部着丝点染色体(m)为12对;亚中部着丝点染色体(sm)为8对;端部着丝点染色体(t)为2对;亚端部着丝点染色体(st)为7对。染色体总臂数(NF)为98,怀头鲇的核型公式为2n=58=24m+16 sm+14 st+4 t。