怀头鲇胃黏膜蛋白酶分离提纯条件的筛选

采用两种硫酸铵饱和梯度盐析方法对怀头鲇Silurus soldatovi胃黏膜蛋白酶激活液进行粗提,用6种组合层析条件对胃蛋白酶粗提液进行Sephadex G-75凝胶过滤层析,获得初步纯化的蛋白酶,并通过蛋白质浓度、蛋白酶活力及SDS-PAGE凝胶电泳对其分析鉴定。结果表明:在28%、56%、83%(NH4)2SO4饱和度条件下分级盐析效果比较理想;不同层析条件下层析峰分离液的蛋白酶活力测定均显示出酶活性,层析峰蛋白酶比活力较粗提液提高5～9倍,60 cm柱(层析柱高52 cm、直径1.6 cm)层析峰分离效果较好。从盐析粗提液电泳结果,以及在60 cm层析柱、pH为3.3的0.01 mol/Lβ-丙氨酸-甲酸缓冲液、0.8mL/min流速条件下的层析峰蛋白分管收集液酶活力峰值和层析峰峰顶形状判断,怀头鲇胃蛋白酶可能有两种蛋白组分存在,并测得相对分子质量为26 000～47 000。     

刺参机体酵母菌组成及其拮抗活性的研究

采用PDA、YPD、MEA培养基从刺参Apostichopus japonicus的体表、肠道和呼吸树分离出23株酵母菌,使用玻璃珠破碎方法提取其DNA,然后用酵母菌通用引物NL-1/NL-4从DNA中成功扩增出26S rDNA片段,将PCR产物进行测序,将各菌株序列在GenBank数据库中进行检索,从Blast比对结果中取相似性最高的序列,用Mega 4.0软件对所有序列进行聚类分析,采用邻接法构建系统发育树。结果表明:从大连柏岚子海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、梅奇酵母属和丝孢酵母属,从大连市黑石礁海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、假丝酵母属、德巴利氏酵母属、有孢汉逊酵母属和毕赤酵母属;以8株刺参病原菌作为指示菌,采用双层琼脂扩散法对分离菌株的拮抗活性进行测定,获得拮抗酵母菌17株,占总测试菌株的73.9%,从刺参机体的体表、肠道和呼吸树可以筛选出不同得率的活性菌株,其抗菌谱和活性强度各不相同,其中C11菌株的抗菌谱最广,抗菌活性最强;从肠道分离出的拮抗菌C11、C14和C21菌株的胞外产物经硫酸铵沉淀后也具有抗菌活性,C14菌株胞外产物经65%硫酸铵沉淀获得的粗提物对热和蛋白酶K敏感,表明其拮抗物质为蛋白质。     

一步法分离石蜡切片DNA的改进与鉴定

目的改进一种以含蛋白酶K的裂解液作用于石蜡包埋处理的细胞、分离DNA粗提液用于PCR扩增的实验方案。方法石蜡包埋组织切片经常规脱蜡处理,用蛋白酶K裂解液洗脱细胞,55℃消化3 h后离心,吸取上清液;分光光度法检测DNA酶裂解液质量和浓度;以之为模板分别扩增人线粒体基因微卫星多态D310区、ATPase6基因区和核基因HBB、BRCA1等的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增情况,并测序验证扩增产物。结果以石蜡切片的DNA裂解粗提液为模板,扩增目的 DNA片段阳性率可达100%;获得序列分析验证。结论改进的蛋白酶K裂解液一步洗脱消化法操作简单、过程快捷、费用低廉,能快速有效地分离石蜡组织切片DNA,用于后续PCR扩增检测,具有较高效率。     

抗菌豆豉发酵菌株的筛选及其脂肽组分鉴定和特性研究

目的:从豆豉中分离广谱抗菌活性菌株,并鉴定其发酵产物中的抗菌成分。方法:采用生理生化实验结合16SrRNA序列测定法鉴定目标分离株,通过LC-MS和ESI/CID技术对其抗菌组分进行鉴定。结果:从8个豆豉样品中分离出7株具有抗菌活性菌株,其中抗菌活性较强的分离株NT-6为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其发酵液抗菌提取物的主要成分是抗菌脂肽类物质iturin、fengycin、surfactin同系物的混合物。该提取物对供试革兰氏阳性、阴性细菌、霉菌等指示菌具有广谱的抗菌活性,在pH 2～12、121℃条件下加热30min活性不丧失,说明具有广泛的pH适应范围和良好的耐热性。结论:该菌株产生多组分抗菌脂肽,其抑菌谱宽,适应性好,显示了在食品、农业、医药等领域具有良好的应用前景。     

全国27所医院多重耐药鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌对12种抗菌药物的敏感性

目的　研究医院感染相关多重耐药鲍曼不动杆菌（multi-drug resistant Acinetobacter baumannii,MDR-AB）及多重耐药铜绿假单胞菌（multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa, MDR-PA）对12种抗菌药物的敏感性。方法　收集2011年8月至2012年7月全国27所教学医院分离的医院感染相关MDR-AB及MDR-PA菌株。所有菌株均分离自有明确感染意义的临床标本，严格排除痰及筛查性拭子。菌株收集后统一在微生物实验室采用微量肉汤稀释法，测定其对12种抗菌药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），并同时用CLSI M100-S24及M100-S23/S21鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的碳青霉烯类新旧折点进行对比分析。结果　本研究共收集到MDR-AB 664株，未发现全耐药鲍曼不动杆菌；收集到MDR-PA 268株，其中有4株全耐药铜绿假单胞菌。外科病房及ICU病房是多重耐药菌株的主要来源。MDR-AB对黏菌素的敏感率最高，为96.8%；替加环素的敏感率为72.6%，其余药物的敏感率均低于55%。MDR-PA对黏菌素的敏感率仅为72.4%，但对阿米卡星的敏感率（64.2%）明显高于MDR-AB（16.7%）。在CLSI折点改变后，MDR-AB对亚胺培南及美罗培南的敏感率仅分别下降了1.3%和0.6%，但MDR-PA对亚胺培南及美罗培南的敏感率分别下降了5.5%和8.6%。ICU病房来源的MDR-AB及MDR-PA对碳青霉烯酶类药物敏感率都明显低于外科及其他病房。不同地域来源多重耐药菌株的耐药谱有所差异。结论　黏菌素和替加环素对MDR-AB有良好的抗菌活性，黏菌素及阿米卡星对MDR-PA抗菌活性较好。     

虹鳟致病性杀鲑气单胞菌的分离鉴定及其毒力因子的检测

为研究虹鳟Oncorhynchus mykiss致病性杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida的致病机理,利用微生物学及分子生物学方法,从患皮肤溃疡病的虹鳟病灶处分离纯化获得1株优势菌株RBWF-1,通过人工感染试验证实其具有较强的致病性。结果表明:菌株RBWF-1对虹鳟的半致死浓度(LD50)为5.5×10⁶CFU/m L;通过对菌株RBWF-1 16S r DNA基因序列扩增、测序及Blast对比,发现其与杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种Asalmonicida subsp.masoucida菌株NBRC 13748及无色亚种A.salmonicida subsp.achromogens菌株NCIMB 1110的16S rDNA基因序列同源性最高,一致性均为99.6%;构建系统发育树显示,菌株RBWF-1与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A.salmonicida subsp.salmonicida、杀日本鲑亚种、无色亚种和史氏亚种A.salmonicida subsp.smithia聚为一支;为进一步明确菌株的分类地位,利用Biolog微生物鉴定系统结合传统生理生化试验对菌株RBWF-1各项理化指标进行检测,经对比,与杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种吻合度最高,因而判断该分离株为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种;同时,对分离菌株的气溶素、溶血素、封闭带毒素、DNA酶、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶、S层蛋白7个毒力相关基因进行了PCR检测,检测结果均呈阳性;酶活性检测结果显示,菌株RBWF-1胞外产物具有蛋白酶、淀粉酶、脂酶、DNA酶和溶血活性。本研究结果可为中国虹鳟养殖过程中杀鲑气单胞菌的感染特征、分类鉴定和疫苗研制提供必要的数据和参考。     

枯草芽孢杆菌BA015对无乳链球菌的拮抗作用及其物质分析

为了从微生态防控的角度寻找水生动物无乳链球菌Streptococcus agalactiae病的防治方法,以21株芽孢杆菌Baciclus作为来源菌株,采用双层平板点种法筛选出19株对无乳链球菌有拮抗作用的菌株,经琼脂平板扩散抑菌试验获得一株对无乳链球菌有较强抑制作用的菌株BA015,并对该菌株进行了进一步研究。结果表明:经生理生化及16S rDNA序列分析确定其为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis;BA015去菌体发酵液(CFS)的80%饱和硫酸铵沉淀物抑菌活性最强,抑菌圈直径达(22.8±1.9)mm;特性分析显示,其与茚三酮水溶液反应呈红色,且对高温、酸碱、蛋白酶、有机溶剂、紫外线均不敏感,符合脂肽类物质的特性;经凝胶柱层析后抑菌最强组分的最小抑菌浓度(MIC)为3.2μg/mL;MALDI-TOF-MS分析显示,其脂肽含有伊枯菌素(Iturin)、杆菌霉素(Bacillomycin)、表面活性素(Surfactin)、芬荠素(Fengycin)等。研究表明,枯草芽孢杆菌BA015及其去菌体发酵液对鱼类无乳链球菌病的防治存在潜在应用价值。     

枯草芽孢杆菌BA015对无乳链球菌的拮抗作用及其物质分析

为了从微生态防控的角度寻找水生动物无乳链球菌Streptococcus agalactiae病的防治方法,以21株芽孢杆菌Baciclus作为来源菌株,采用双层平板点种法筛选出19株对无乳链球菌有拮抗作用的菌株,经琼脂平板扩散抑菌试验获得一株对无乳链球菌有较强抑制作用的菌株BA015,并对该菌株进行了进一步研究。结果表明:经生理生化及16S rDNA序列分析确定其为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis;BA015去菌体发酵液(CFS)的80%饱和硫酸铵沉淀物抑菌活性最强,抑菌圈直径达(22.8±1.9)mm;特性分析显示,其与茚三酮水溶液反应呈红色,且对高温、酸碱、蛋白酶、有机溶剂、紫外线均不敏感,符合脂肽类物质的特性;经凝胶柱层析后抑菌最强组分的最小抑菌浓度(MIC)为3.2μg/mL;MALDI-TOF-MS分析显示,其脂肽含有伊枯菌素(Iturin)、杆菌霉素(Bacillomycin)、表面活性素(Surfactin)、芬荠素(Fengycin)等。研究表明,枯草芽孢杆菌BA015及其去菌体发酵液对鱼类无乳链球菌病的防治存在潜在应用价值。     

猪源高产蛋白酶芽胞杆菌的分离与鉴定

利用酪蛋白培养基从猪粪便样品中分离产蛋白酶的芽胞杆菌,采用福林酚法测定其酶活力,对筛选到的高酶活菌株进行形态学、生理生化和分子鉴定。结果表明,从86株分离菌中筛选了一株酶活较大的菌株B.A464,革兰氏阳性菌,呈粗杆状,能形成卵圆形芽孢,16S rDNA序列长度是1 463 bp,与蜡样芽孢杆菌的同源性高达99%,鉴定为蜡样芽孢杆菌,所产蛋白酶活力为2.19×103U·mL-1。     

水貂源大肠杆菌对9种抗菌药物敏感性试验

为了解水貂源大肠杆菌对抗菌药物的敏感性,指导兽医临床有效防治大肠杆菌病.采集山东省某水貂养殖场水貂粪便;采用常规的分离、鉴定方法获得8株大肠杆菌菌株;采用K-B纸片扩散法检测菌株对9种抗菌药物的药物敏感性.结果表明,菌株对9种药物呈不同水平的耐药性(耐药率范围25.0~100.0%),对妥布霉素、阿米卡星100%耐药;对粘杆菌素、氟喹诺酮类呈较低耐药率;62.5%的菌株对所检测的8种药物耐药.以上结果说明了本次检测的水貂源大肠杆菌耐药性非常严重,临床上应根据药敏试验结果,合理和谨慎地使用抗菌药物以控制水貂大肠杆菌病.