鱼肠道弧菌单克隆抗体的制备及应用

以鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri为抗原免疫小鼠,用PEG法将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,分别采用酶联免疫吸附(ELISA)技术和间接免疫荧光抗体(EFAT)技术筛选强阳性杂交瘤细胞株,亚克隆阳性细胞株,获得5株抗鱼肠道弧菌单克隆抗体(1C6、1D8、2D7、2D10、2E3)。Western blotting分析结果显示,单抗2D10与相对分子质量为44 200、36 700的鱼肠道弧菌蛋白发生特异性结合;用流式细胞术(FCM)检测单抗强度,结果显示阳性荧光比例为13.63%,阴性对照荧光比例不足1%;人工感染牙鲆试验结果表明,运用该单抗能够建立鱼肠道弧菌的快速诊断方法。     

黄海希瓦氏菌多克隆抗体部分特性的分析

采用免疫学方法,以仿刺参Apostichopus japonicus"化皮病"病原菌——黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi AP629福尔马林灭活疫苗作为免疫原,对新西兰大白兔进行免疫,制备了高效价的多克隆抗体。通过间接酶联免疫、间接免疫荧光和免疫印迹等技术对多克隆抗体的部分特性进行了分析。结果表明:获得的多克隆抗体的效价为1∶32768;多抗与黄海希瓦氏菌标准菌株存在很强的阳性反应,与弧菌和气单胞菌、链球菌和大肠杆菌交叉反应很弱或不存在交叉反应;多抗不仅与菌体本身反应,与菌株表面的分泌物也发生特异性结合。免疫印迹结果显示,多克隆抗体与黄海希瓦氏菌AP629结合的抗原决定簇主要蛋白带有6条,相对分子质量分别为131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白条带的抗原性最强;与胞外产物结合的抗原决定簇清楚的蛋白条带主要有3条,相对分子质量分别为62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白条带的信号最强。     

哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用

从致病性哈维氏弧菌Vibrio harveyi SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶(trxR)基因的1 133bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple。测序结果表明,目的片段含有960 bp trxR基因阅读框,编码为319个氨基酸残基的蛋白质。Blast分析结果显示,硫氧还蛋白还原酶蛋白氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列的相似性分别为99%、98%、96%、94%、92%。构建表达质粒pET-28a(+)/TrxR后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白的相对分子质量为34 000。用Ni琼脂糖亲和层析柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆Scophthalmus maximus,用ELISA法检测免疫1～4周内鱼血清中特异性抗体的效价。结果表明,特异性抗体效价持续升高,第2周则达到1∶128。免疫4周后用哈维氏弧菌SF1对大菱鲆进行人工感染,对照组鱼的死亡率为100%,免疫组鱼的死亡率为25%,相对免疫保护力为75%。试验表明,哈维氏弧菌TrxR蛋白具有较好的免疫原性,可作为潜在的亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。     

哲罗鲑雌性蛋白的研究

采用柱层析、蛋白质免疫印迹和电泳等方法,对哲罗鲑Hucho taimen的雌性蛋白进行了系统研究。结果表明:哲罗鲑血清和卵黄中均存在雌性蛋白,其雌性蛋白的性质相同,均为糖脂磷蛋白;与血清雌性特异蛋白一样,卵黄雌性特异蛋白的相对分子质量也为460 000,由相对分子质量分别为137 800、84 200和10 800的3个亚基组成,等电点为5.60;卵黄雌性蛋白的兔抗血清均与哲罗鲑雌性血清发生免疫反应,不与雄性血清发生免疫反应,表明这两种蛋白均具有雌性特异性;两种蛋白的抗血清可以相互检测,表明哲罗鲑雌鱼血清中雌性蛋白与卵黄中的雌性蛋白在免疫原性上和结构上具有较高的同源性。     

蟹源副溶血弧菌胞外蛋白酶的纯化与特性分析

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Cellulose离子交换柱层析等方法,从中华绒螯蟹Eriocheir sinensis弧菌病病原菌——副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的胞外产物中分离纯化出两种具有致病作用的胞外蛋白酶。相对分子质量为39 600的蛋白酶是一种金属蛋白酶,EDTA可抑制其活性,金属离子Cu2+、Mg2+、Fe2+对该酶有抑制作用,而Ca2+对其则有一定程度的激活作用;该酶在50⁶0℃下热稳定性最好,最适pH为9。而相对分子质量为20 000的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,EDTA对其酶活力几乎没有影响,但苯甲基磺酰氟(PMSF)可抑制其酶活性;该酶的最适温度为50℃,最适pH为8。     

用美人鱼弧菌与创伤弧菌人工感染卵形鲳鲹的组织病理学研究

用美人鱼弧菌Vibrio damsela与创伤弧菌V.vulnificus人工感染卵形鲳鲹Trachinotus ovatus后,对病鱼的组织病理变化进行了观察和分析。结果显示:美人鱼弧菌与创伤弧菌均能引起鱼的鳃、肝、脾、肠、胃、肾等多种组织器官发生较为严重的病理变化,且这两种弧菌导致的病鱼组织病理变化存在较多的相似性。病鱼鳃严重病变,鳃小片上皮细胞增生,相互融合在一起呈棍棒状,鳃小片基部的泌氯细胞肥大,有的泌氯细胞与鳃小片上皮细胞层连在一起;肝严重出血或发生脂肪变性,肝组织结构疏松,肝细胞变性坏死;胃、肠黏膜变性坏死,脾、肾出血;肾小球、肾小管与肾间质变性坏死等。     

虹鳟IPNV分离株VP2蛋白的表达及免疫原性检测

为充分了解中国鱼类传染性胰腺坏死病病毒的系统进化,对流行病学调查分离出的虹鳟Oncorhynchus mykiss传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)分离株进行了系统进化分析,利用软件综合分析了IPNV病毒表面蛋白VP2的跨膜区、亲水性、抗原性和表面可能性,对其特定区段进行了原核表达,并利用表达蛋白制备鼠抗血清及免疫学鉴定。结果表明:本实验室得到的分离株与中国已报道的毒株具有不同的来源;SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP2蛋白为单一条带,相对分子质量约为45 000;ELISA分析显示,利用表达蛋白制备的鼠抗血清与IPNV分离株细胞培养物的效价为1∶20 000,与VP2蛋白的效价为1∶40 000;间接免疫荧光分析显示,细胞感染IPNV病毒24、48 h后,该鼠抗血清均能与IPNV毒株发生特异性反应,并呈现出特异性绿色荧光。研究表明,本研究中表达的VP2蛋白与IPNV病毒的VP2蛋白具有相近的免疫原性,这一结果为IPNV检测方法的建立及疫苗的构建提供了重要的试验依据。     

虹鳟IPNV分离株VP2蛋白的表达及免疫原性检测

为充分了解中国鱼类传染性胰腺坏死病病毒的系统进化,对流行病学调查分离出的虹鳟Oncorhynchus mykiss传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)分离株进行了系统进化分析,利用软件综合分析了IPNV病毒表面蛋白VP2的跨膜区、亲水性、抗原性和表面可能性,对其特定区段进行了原核表达,并利用表达蛋白制备鼠抗血清及免疫学鉴定。结果表明:本实验室得到的分离株与中国已报道的毒株具有不同的来源;SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP2蛋白为单一条带,相对分子质量约为45 000;ELISA分析显示,利用表达蛋白制备的鼠抗血清与IPNV分离株细胞培养物的效价为1∶20 000,与VP2蛋白的效价为1∶40 000;间接免疫荧光分析显示,细胞感染IPNV病毒24、48 h后,该鼠抗血清均能与IPNV毒株发生特异性反应,并呈现出特异性绿色荧光。研究表明,本研究中表达的VP2蛋白与IPNV病毒的VP2蛋白具有相近的免疫原性,这一结果为IPNV检测方法的建立及疫苗的构建提供了重要的试验依据。     

仿刺参不同组织液的抗菌活性

采用平板菌落计数法测定仿刺参Apostichopus japonicus体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液和体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌Vibrio harveyi的抑制作用,并对健康仿刺参与感染后仿刺参的体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用进行了比较;采用乙醇沉淀、离心等方法从仿刺参体壁内皮组织中粗提得到一种水溶性成分,测定了该成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌Staphylococcus albus和迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda的抑菌活性,并初步研究了该成分的基本性质。结果表明:仿刺参体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌的抑制效果显著,体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液对哈氏弧菌的抑制效果不显著;感染状态下,仿刺参体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用与健康状态相比有所降低。提取的水溶性成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌和迟钝爱德华氏菌均有明显的抑制作用;该成分的茚三酮反应呈阳性,其中蛋白质的质量分数为17.48%;该成分经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到5个蛋白条带,相对分子质量大约为55 300、46 100、34 700、19 500和14 500,初步认为其含有肽类抗菌活性物质。     

传染性胰脏坏死病毒VP3抗血清的制备及应用

为丰富传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreas necrosis virus, IPNV)的检测方法,以GenogroupⅠ型的IPNV ChRtm213分离株基因组RNA为模板,利用一步法RT-PCR扩增获得了编码IPNV VP3基因序列(711 bp),将其克隆至pET-32a原核表达载体,利用大肠杆菌Rosetta进行VP3蛋白表达,以纯化的VP3蛋白为免疫原制备鼠抗血清,利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)对抗血清效价进行测定,并利用间接免疫荧光抗体法(indirect immunofluorescent antibody test, IFAT)和中国不同地区的IPNV分离株,对抗血清识别中国现行IPNV分离株的能力进行免疫学鉴定。结果表明:SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP3蛋白条带单一,相对分子质量约为45 000,与理论值相符;抗血清效价分析显示,所制备的鼠抗IPNV VP3血清与IPNV的反应效价为16 000,与纯化的IPNV VP3蛋白的反应效价为32 000;间接免疫荧光抗体法分析显示,制备的鼠抗血清能够特异性识别中国不同地区的GenogroupⅠ和GenogroupⅤIPNV分离株,且该血清不与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(VHSV)发生交叉反应,具备较好的特异性。研究表明,本研究中利用原核表达系统表达的IPNV VP3蛋白具有良好的免疫原性,所制备的IPNV VP3抗血清能够特异性识别中国不同地区的IPNV分离株。     

环境因子对对虾弧菌致病性的影响

对虾弧菌病是对虾养殖过程中危害最严重的细菌性疾病之一。文章对对虾弧菌病的病理特征、弧菌种类以及环境因子对对虾弧菌致病性影响作以简述。     

Adverse effects of organic arsenical compounds towards Vibrio fischeri bacteria

The most frequently encountered forms of organic arsenic, namely, dimethylarsinic acid, monomethylarsonic acid, arsenobetaine, arsenocholine and Roxarsone (4-hydroxy-3-nitrobenzene arsonic acid) were tested for toxicity either by using the Microtox bioassay, based on the rapid (within 15 min) fading of luminescence emitted by Vibrio fischeri marine bacteria, or by monitoring growth rate of the same bacteria for 3 days. Organic arsenic was generally found to be less toxic to these biological models than inorganic arsenic. In many cases, EC50 values for DMA, MMA or HNAA when using luminescence or growth inhibition assays could not be determined because of the low toxicity of the compounds. Nevertheless, results from the luminescence inhibition assay, which was found to be more sensitive than the growth inhibition assay, allowed to rank toxicity as follows: arsenate at pH 8>HNAA at pH 5>arsenate at pH 5>MMA at pH 5>HNAA at pH 8>DMA at pH 5. Arsenobetaine and monomethylarsonic acid were unexpectedly found to stimulate bacterial growth (hormesis effect). pH was found to have a strong influence on the observed toxicity as a consequence of the pH-induced changes in the chemical speciation of the tested molecules. In most cases it appeared that negatively charged forms were less toxic than the uncharged ones.     

虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的PCR检测方法

强壮弧菌Vibrio fortis是虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的一种致病菌。为建立强壮弧菌的PCR检测方法,根据强壮弧菌gyrB基因的高度变异区序列设计引物,筛选出特异性强的3对引物VF-6、VF-7及VF-8,分别对强壮弧菌S0907及20株参比菌株进行PCR扩增,结果显示,3对引物均对强壮弧菌扩增出与预期大小一致的目的基因片段且参考菌株无扩增条带。以不同稀释度的菌悬液制备的DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低细菌浓度分别为4.1×104、4.1×103、4.1×102 cfu/mL;对不同稀释度的细菌DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低DNA含量分别为1.4、0.14、0.014 pg/μL。试验结果表明:3对引物的特异性均较好,但灵敏度存在差异,其中以VF-8为引物的PCR检测方法最佳;使用以VF-8为引物的PCR检测方法对实验室养殖海胆及其生境样品进行初步检测,健康海胆、养殖海水及投喂的海带均为阴性,而自然海域海水中带有一定量的强壮弧菌。     

补救教学的国际经验与本土建构

补救教学是以政府为主导、多方力量参与和为改进低成就学生的学业表现而开展的公益性教育援助。补救教学是促进教育公平和提高教育质量的重要教学活动,在国外大致经历了萌芽兴起、发展完善和成熟扩展三个阶段。世界各国补救教学取得了丰富的理论与实践经验,补救对象不断扩展,补救内容愈益丰富,补救模式愈加多样,保障措施日趋完善。在新时代深化教育综合改革的背景下,应借鉴国外补救教学理论成果,强化本土化理论研究,尝试构建中小学补救教学体系,促进基础教育优质均衡发展,为社会的公平正义提供基础性保障。     

不同氮源对一株溶藻弧菌好氧反硝化效率的影响

为研究溶藻弧菌Vibrio alginolyticus HA2同步硝化反硝化过程中氮的代谢产物,分别用以铵态氮(NH_4⁺-N)、硝态氮(NO_3+-N)、硝态氮(NO_3^--N)、亚硝态氮(NO_2--N)、亚硝态氮(NO_2^--N)为氮源的培养基培养溶藻弧菌HA2 120 h,测定不同时间段菌液浓度,以及NH_4--N)为氮源的培养基培养溶藻弧菌HA2 120 h,测定不同时间段菌液浓度,以及NH_4⁺-N、NO_3+-N、NO_3^--N、NO_2--N、NO_2^--N、pH和发酵罐中气体(N_2、NO、N_2O)的含量,并且拟合菌株生长曲线。结果表明:溶藻弧菌对NH_4--N、pH和发酵罐中气体(N_2、NO、N_2O)的含量,并且拟合菌株生长曲线。结果表明:溶藻弧菌对NH_4⁺-N、NO_3+-N、NO_3^--N、NO_2--N、NO_2^--N降解率最高分别为99.97%、99.95%、36.87%;生长极限k值分别为4.769、5.477、5.567;培养基中的NH_4--N降解率最高分别为99.97%、99.95%、36.87%;生长极限k值分别为4.769、5.477、5.567;培养基中的NH_4⁺-N直接被氧化为NO_3+-N直接被氧化为NO_3^--N;试验中均未检测出NO、N_2O气体,各培养基中N_2量均有上升趋势;各培养基中pH均有增加趋势。研究表明,溶藻弧菌HA2具有开发为高效、环保、安全的硝化反硝化细菌的研究价值。     

哈维氏弧菌溶血素的包涵体纯化、多抗制备及活性验证

为进一步研究哈维氏弧菌溶血素(Vibrio harveyi hemolysin, VHH)的生物学功能,构建了vhh原核表达载体,并利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用DOT-ELISA和Western-blot方法检测抗体的效价及特异性,并通过溶血试验评估抗体对哈维氏弧菌培养物上清溶血活性的影响。结果表明:在构建得到的表达菌株pET28a-vhh-BL21(DE3)中,重组蛋白以包涵体形式大量表达;对该重组蛋白进行纯化并复性后,利用纯化的蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体效价为1∶163 840,可特异性识别VHH蛋白,且稀释倍数小于1000时,可显著抑制哈维氏弧菌培养物上清的溶血活性。本研究结果对VHH单抗的制备、哈维氏弧菌检测手段的完善及哈维氏弧菌的疫苗研发具有一定参考作用。     

Sediment-water exchange of Vibrio sp. and fecal indicator bacteria: implications for persistence and transport in the Neuse River Estuary, North Carolina, USA

In estuaries, frequent resuspension and deposition of sediment complicate bacterial transport model development by transporting particle-attached bacteria and possibly inducing bacterial responses, such as growth, degradation, or changes in attachment. In order to better characterize these dynamics, observations were made in the Neuse River Estuary (NRE) using the combination of an in situ sampler to monitor the water column and sediment cores to monitor sediment concentrations. Two allochthonous bacteria, Escherichia coli (EC) and Enterococcus sp. (ENT), were selected as proxies for fecal contamination from stormwater runoff. Vibrio sp. (VIB), native to the NRE, was also observed as an autochthonous bacterial group that includes potentially pathogenic species. Two sampling periods were identified as dominated by different suspension types: runoff and resuspension. Despite this difference, several bacterial measures remained comparable between sampling periods. In bottom water, VIB concentration was correlated with salinity and ENT concentration was correlated with turbidity. Differences were observed for EC, where higher concentrations were found in hypoxic waters and sediment during the resuspension period. In the sediment, EC and VIB concentrations significantly increased following the passage of Hurricane Ophelia in September 2005. Throughout this study, all bacterial groups showed evidence of persistence in sediment, suggesting that sediment resuspension represents a significant source of bacteria to the water column.