中华鳖细菌疫苗免疫佐剂的筛选及其初步应用

将分离自中华鳖Trionyxsinensis主要细菌性疾病——肠道出血性败血症、鳖穿孔病(疖疮病)、红脖子红底板病、鳖腐皮病的4株病原菌,在体积分数为3.5%的福尔马林溶液中灭活24 h。在灭活的4株菌中添加不同佐剂,充分混匀后分别制备成总含菌量为6×109个/mL的4价菌苗,分别免疫8只ICR小鼠,并设不加佐剂免疫组及空白组作为对照。经3次免疫后,随机选3只小鼠抽血制备血清,用间接ELISA方法测定抗体效价,除空白对照组外,其它4组小鼠的免疫血清效价为1∶1.6×104～1∶2.56×105,各免疫组的效价依次为弗氏佐剂>白油佐剂>蜂胶佐剂>不加佐剂。另外5只小鼠用于免疫保护性试验。结果表明:3种佐剂的免疫保护率均为100%,而不加佐剂组免疫保护率为80%,空白对照组死亡率为100%。考虑到弗氏佐剂的成本较高且白油佐剂有副作用,故选择蜂胶作为免疫佐剂,制备了中华鳖4价菌苗。用该菌苗免疫接种50只体重为100～150 g/只的健康中华鳖,注射剂量为0.2 mL/只,并设置对照组(注射等量的生理盐水),共接种20只健康中华鳖。分别于免疫后第20、30、40、50天随机采集3只受免疫的中华鳖和对照组的1只中华鳖血液并制备血清,用浙江省淡水水产研究所制备的针对中华鳖IgM的单抗3H3介导的ELISA方法,测定血清中的抗体效价。结果表明:当中华鳖免疫后40 d,血清中抗体效价达到最高,为1∶6.4×104;免疫后50 d将受免中华鳖分成4组,分别用4种菌株以5LD50(9×106个/mL)进行攻毒试验(0.5 mL/只),结果免疫保护率均达到100%,而对照组死亡率均为100%。     

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)抗体效价与鸡攻毒保护相关性试验

实验室制备的三联灭活疫苗分别以不同免疫剂量免疫接种21日龄SPF鸡,免疫后21日,分别采血测定血清抗体效价,并根据抗体效价重新分组,进行攻毒保护试验。试验结果表明,三联灭活疫苗各组分抗体效价与攻毒保护均呈正相关,疫苗各组分抗体效价可代替动物效检试验。根据试验结果及我国兽药标准,将三联灭活疫苗血清标准确定为:新城疫病毒HI抗体效价的几何平均值应≥1:16;禽流感(H9亚型)病毒HI抗体效价的几何平均值应≥1:128;Ⅰ群4型禽腺病毒抗体效价应≥1:1。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)糖蛋白E2单克隆抗体(MAb),利用原核表达并且纯化的重组糖蛋白E2(rE2)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用以BVDV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗E2特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4E3与1G11。用4E3与1G11杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠制备腹水,采用rE2及BVDV包被的ELISA测得的效价分别是6.21×106和6.83×105及6.83×105和7.5×104。间接ELISA、Western blot、IFA试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定4E3与1G11均为IgM/κ。特异性试验表明4E3与1G11这2株MAb均不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛腺病毒3型反应;其中4E3不与猪瘟病毒反应,而1G11则可与猪瘟病毒发生交叉反应,这种反应特性可试用于BVDV与猪瘟病毒的鉴别诊断。所制备的4E3与1G11 MAb可以用于BVDV抗原的检测,为建立检测BVDV E2蛋白血清抗体的ELISA奠定了基础。     

白斑综合征病毒单克隆抗体的制备及BA-ELISA方法的建立

白斑综合征病毒(white spot syndrom virus,WSSV)是甲壳类动物的重要病原,作者采用提纯的WSSV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,共得到3株能特异分泌抗WSSV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞(1E9、1E10、4F5)。将3株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶104¹05。1E9、4F5的抗体亚型均为IgG1,1E10的抗体亚型为IgG2b。特异性实验表明:3株单抗与虾类病原桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、哈维氏弧菌(V.harveyi)均无交叉反应。Western bolt分析表明:单抗1E9与病毒28kD外膜蛋白特异性结合。采用生物素标记纯化后的单抗1E9,并建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(Biotin-Adivin ELISA,BA-ELISA)用于WSSV的检测,该方法对提纯病毒的检测灵敏度约为4 ng,对病虾血淋巴的检测灵敏度达1∶25000。     

抗心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体制备、鉴定和在侧向免疫层析方法中的应用

目的:制备抗心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)单克隆抗体(mAb),并建立侧向免疫层析方法检测血浆中H-FABP。方法:用H-FABP蛋白免疫纯系Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术建立能稳定分泌抗人H-FABP的单克隆杂交瘤细胞株。常规制备腹水,纯化后得到特异性抗H-FABP单克隆抗体,进行效价、特异性、亲和力的鉴定分析,并在ELISA平台进行抗体配对,用所筛选到的抗体对初步建立了检测H-FABP的侧向免疫层析方法。结果:成功获得12株稳定分泌抗体的阳性细胞株,并筛选出能相互配对,并应用于侧向免疫层析平台的抗体3D1和5F4,检测临床样品与对照试剂比较总符合率为100%。结论:筛选能稳定分泌抗体的细胞株,配对抗体应用于侧向免疫层析检测方法中,能快速、特异、灵敏的检测出临床样品中H-FABP,为临床应用快速检测H-FABP指标提供了方法和关键材料。     

鸡抗迟缓爱德华氏菌卵黄抗体的应用研究

从全身出血合并腹水的养殖大菱鲆Scophthalmus maximus体内分离出1株细菌,经感染试验证实其病原性,并鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda。采用该菌制成全菌油乳性灭活疫苗,分4次给蛋鸡进行免疫注射,第2次加强免疫后开始收集鸡蛋,制备卵黄抗体(IgY)和其水溶性组分(W SF),并用试管凝集法测定其效价。取效价达到1∶64的鸡蛋提取卵黄抗体,分别采用口服和腹腔注射两种方式给大菱鲆进行免疫:配成含W SF 1 mL/g的饵料,给鱼连续投喂15 d;用含蛋白含量0.19 mg/mL的纯化IgY,于第1、3、14 d对大菱鲆进行腹腔注射,剂量为0.1 mL尾/。免疫后分别用注射和划伤浸泡两种方法攻毒。结果表明,口服特异性卵黄抗体对大菱鲆的免疫保护率分别为83.3%和100%,而注射免疫没有保护作用。     

重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗免疫SPF鸭免疫持续期试验

试验对重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗免疫SPF鸭后的免疫持续期进行了研究。选用14日龄SPF鸭20只,其中10只鸭的腿部肌肉接种免疫灭活疫苗,剂量为0.5 m L·只-1,另10只不接种的鸭作为对照组。结果表明,免疫后14 d可以产生较高的免疫力,H5N1 Re-8株的抗体效价平均增值为5.6 log2,H7N9 H7-Re-1株的抗体效价平均增值为6.6 log2。到35 d产生的HI抗体效价平均值达到高峰,H5N1 Re-8株的抗体效价平均增值为8.6 log2,H7N9 H7-Re-1株的抗体效价平均增值为9.5 log2。第120天H5N1 Re-8株抗体效价平均值为4 log2,H7N9 H7-Re-1株的抗体效价平均值均为5 log2,为抗体的保护临界值。根据此数据分析,一次免疫的免疫保护期约为120 d。     

重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)免疫SPF鸭免疫持续期试验

试验对重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)免疫SPF鸭后的免疫持续期进行研究。选用14日龄SPF鸭20只,其中10只腿部肌肉免疫灭活疫苗0.5 mL·只~(-1),另10只不接种作为对照组。结果表明,免疫后14 d可以产生免疫力,Re-6株的抗体效价平均值为6.0 log2,Re-7株的抗体效价平均值为6.0 log2,Re-8株的抗体效价平均增值为6.7 log2。免疫后35 d产生的HI抗体效价平均值达到高峰,Re-6株的抗体效价平均值为9.3 log2,Re-7株的抗体效价平均值为9.1 log2,Re-8株的抗体效价平增值为9.3 log2。免疫后120 d,Re-6株的抗体效价平均值为7.0 log2,Re-7株的抗体效价平均增值为7.1 log2,Re-8株的抗体效价平均值为7.5 log2。根据此数据分析,首次免疫的免疫保护期约为120 d。     

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)抗体产生期和免疫持续期试验

以实验室制备的3批制品各经颈部皮下接种7日龄和21日龄SPF鸡,7日龄鸡于免疫后7、11、14、21、28 d及1、2和3个月;21日龄鸡于免疫后7、11、14、21、28 d及1、2、3、4和5个月时采血,分离血清,分别测定免疫鸡血清中鸡新城疫病毒、禽流感(H9亚型)病毒和禽腺病毒抗体效价。试验结果表明,实验室3批制品免疫7日龄SPF鸡后,免疫后11 d鸡新城疫病毒、禽流感(H9亚型)产生抗体,21～28 d时3种病毒抗体均达到抗体高峰,高峰期持续至免疫后1个月,免疫后3个月下降到有效保护标准以下。三联疫苗免疫21日龄SPF鸡,免疫后11 d鸡新城疫病毒、禽流感(H9亚型)产生抗体,针对3种病毒的抗体在免疫后21～28 d达到抗体高峰,高峰期持续至免疫后2个月,免疫后3个月开始下降,免疫后5个月下降到有效保护标准以下。因此,鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)免疫<2周龄的鸡免疫持续期为2个月,免疫>2周龄的鸡免疫持续期为4个月。     

单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备与鉴定

以单核细胞增生李斯特菌细胞碎片免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法成功筛选获得2株稳定分泌抗LM的单克隆杂交瘤细胞株4A7、4H11。抗体效价为1∶160 000以及1∶20 000,亚型为IgG1、IgG2a,Dot-ELISA结果表明4A7和4H11单克隆抗体具有很好的属特异性,Western blot分析表明4A7、4H11抗体分别与单核细胞增生李斯特菌62 kDa以及32 kDa外膜蛋白抗原表位结合,胶体金免疫电镜实验进一步确证以上抗体可有效识别单核细胞增生李斯特菌细胞表面抗原。