基于分子动力学的miRNA 3'端与Argonaute蛋白PAZ功能域相互作用的研究

应用分子动力学方法研究了人类miRNA 3'末端3碱基与PAZ功能域的结合模式,并采用线性相互作用能方法计算miRNA 3'末端片段与PAZ之间的结合自由能。结果表明:miRNA 3'末端碱基组成决定了其和PAZ功能域的结合模式以及结合自由能,UGU与PAZ的结合最为稳定,结合自由能为-37.248kJ/mol,而CGA与PAZ的结合情况相对不太稳定,结合自由能为-5.418 kJ/mol;miRNA 3'端与PAZ的结合自由能与其在人类miRNA基因中的分布频率存在一定的相关性,UGU在人类基因中占6.768%,而CGA仅占0.414%。本研究结果可为进一步研究miRNA与Argonaute蛋白的相互作用以及对人类疾病防治和生物进化探索提供重要信息。     

以柯萨奇B3病毒3C蛋白酶为靶点的体外药物筛选模型的建立及应用

建立以柯萨奇B组3型病毒3C蛋白酶(CVB3-3C)为靶点的药物筛选模型,并筛选新型抑制剂。使用原核表达模型实现CVB3-3C蛋白酶体外重组表达。经Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析纯化获得高纯度CVB3-3C蛋白。应用荧光共振能量转移法检测蛋白酶活性,建立药物筛选模型。对768种化合物进行筛选,获得了2种对CVB3-3C蛋白酶有较强抑制作用的化合物(MDCE-A008和MDCE-A043),IC50值分别为(60.61±6.26)μmol/L、(105.7±14.88)μmol/L。建立的CVB3-3C蛋白酶药物筛选模型为获得有效抑制剂提供了技术保证。     

基于MFCC方法计算表皮生长因子受体与4-苯胺基喹唑啉结合的量子力学机制

基于最近发展的分子碎片共轭帽(molecular fractionation with conjugate caps,MFCC)方法,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)与其抑制剂的相互作用能得以用完整的量子力学来计算,主要包括上市的Iressa[第一代美国食品及药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)通过的药物]和4-苯胺基喹唑啉类抑制剂Tarceva(已上市)、CI-1033与EKI-785。对EGFR的完整体系(超过5 000个原子)与4-苯胺基喹唑啉类抑制剂之间的结合作用采用了量子力学计算方法。结合体系的量子能量计算,用Hartree-Fock与密度泛函理论(density functional theory,DFT)2种方法,EGFR与Tarceva之间的相互作用能基于它们两者复合物的晶体结构得到,而其他抑制剂与EGFR的相互作用能则通过分子对接软件预测的构型进行计算。利用MFCC方法,获得了量子相互作用能谱,清楚地给出了EGFR每个氨基酸片段与4-苯胺基喹唑啉类抑制剂之间的单个相互作用能。量子研究发现,4-苯胺基喹唑啉类抑制剂与EGFR的结合通过1个氢键和静电相互作用。Iressa、Tarceva、CI-1033、EKI-785与EGFR的结合能计算值分别为-40.23、-53.09、-33.92、-31.47kcal/mol(1cal=4.184J)。研究表明,Tarceva比第一代FDA通过的药物Iressa有更强的结合能力,而CI-1033、EKI-785则表现出一般的结合作用,另外,与MFCC计算的相互作用能谱相比,有一些相互作用在力场作用能谱中被明显高估。     

重组不可分型流感嗜血杆菌E蛋白与血浆脂蛋白(a)的相互作用

目的:E蛋白(Protein E,PE)是不可分型流感嗜血杆菌(Nontypeable Haemophilus influenza,NTHi)表面的一种纤溶酶原(plasminogen,Plg)受体,其C末端含有两个赖氨酸残基。NTHi可通过其表面的PE与Plg结合,从而利用机体的纤溶系统深层入侵宿主。基于脂蛋白(a)[Lipoprotein(a),Lp(a)]中载脂蛋白(a)[Apolipoprotein(a),Apo(a)]与Plg高度的同源性,拟证明Lp(a)是否会与重组表达的PE(r PE)结合。方法:原核表达并纯化r PE及敲除C末端两个赖氨酸残基的r PEΔKK,密度梯度离心结合阴离子交换层析分离人血浆Lp(a),通过ELISA、Pull down、Western blot等方法研究r PE与Lp(a)的相互作用。结果:r PE与Lp(a)结合,但不与LDL结合,且r PEΔKK与Lp(a)的结合能力明显低于r PE;赖氨酸类似物6-氨基乙酸(EACA)能有效抑制r PE与Lp(a)的结合;Lp(a)对r PE与Plg的结合具有微弱的抑制作用。结论:r PE能够与Lp(a)结合,其中r PE的C末端赖氨酸残基和Apo(a)的赖氨酸结合位点(lysine binding sites,LBS)是r PE与Lp(a)结合的主要位点。     

季铵盐双子表面活性剂自组装增黏机制研究

采用实验和粗粒化分子动力学(CGMD)模拟相结合的方法研究N,N'-双(十六烷基二甲基)-1,2-二溴化丁二铵盐(16-4-16)自组装增黏机制;通过反向非平衡态分子动力学(RNEMD)模拟的方法研究蠕虫状胶束体系黏度。结果表明:双子表面活性剂具有较好的增黏效果,随着双子表面活性剂浓度增加,胶束尺寸逐渐增大;双子表面活性剂具有较低的胶束融合自由能,表现出更强的聚集能力,更容易聚集形成蠕虫状胶束。     

清温解毒方治疗重症系统性红斑狼疮

目的:观察清温解毒方治疗重症系统性红斑狼疮的临床疗效。方法:75例重症红斑狼疮患者随机分为中西医结合组36例,单用西药组39例。中西医结合组给予清温解毒方伍用免疫抑制剂,单用西药组给予免疫抑制剂。比较两组患者中医证候积分、BILAG-2004积分、SLEDAI-2000积分、抗双链DNA抗体及不良反应。结果:中西医结合组有效率为88.89%,高于单用西药组的69.23%(P<0.05)。两组患者治疗后BILAG-2004积分及SLEDAI-2000积分显著低于治疗前(P<0.05),中西医结合组中医证候积分、BILAG-2004积分低于单用西药组(P<0.05)。两组患者治疗后IgG水平显著低于治疗前(P<0.05)。两组患者治疗后补体C3水平显著高于治疗前(P<0.05),且中西医结合组以上指标高于单用西药组(P<0.05)。中西医结合组抗双链DNA抗体转阴率(50.00%)高于单用西药组(35.71%)。中西医结合组感染率(36.11%)、骨髓抑制率(13.89%)显著低于单用西药组(58.97%、33.33%),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:清温解毒方治疗重症系统性红斑狼疮疗效显著,可显著降低患者中医证候积分、BILAG-2004积分及SLEDAI-2000积分,升高补体C3水平、抗双链DNA抗体转阴率,降低感染率、骨髓抑制率。     

β-1,4-葡聚糖内切酶egl3基因在乳酸乳球菌中分泌表达的研究

研究采用重叠延伸PCR合成技术将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌蛋白基因序列usp45(81bp)和瑞氏木霉(Trichoderma reesei)β-1,4-葡聚糖内切酶成熟蛋白序列egl3(657bp)连接成融合基因usp45-egl3,构建了分泌型重组质粒pMG36eusp45-egl3及重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-egl3,分析了重组乳酸乳球菌表达β-1,4-葡聚糖内切酶的效果及其降解滤纸和小麦秸秆的能力。结果表明,重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-egl3经28h培养能胞外分泌酶活为1 016U/L的β-1,4-葡聚糖内切酶,有效地降解了羧甲基纤维素钠。在30℃恒温培养10d时,重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-egl3降解滤纸和小麦秸秆为其提供发酵底物,分别产生乳酸2.55g/L和6.95g/L,pH分别降至5.10和4.84,干物质降解率分别为4.22%和29.36%。     

槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

目的探讨槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响及其机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和油红O染色检测不同浓度(10、30、50、100μmol/L)的槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响,荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和CAA T/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的表达。结果 10～100μmol/L槟榔碱作用3T3-L1前脂肪细胞12 h和24 h能促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,且呈一定的量效关系。到分化的第9天,与对照组相比,50μmol/L槟榔碱组胞浆中的脂滴明显减少,同时PPARγ和C/EBPαmRNA表达水平显著降低。结论槟榔碱能促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖、抑制其分化,其机制可能与PPARγ和C/EBPα的表达降低有关。     

四君子汤联合乌司他丁治疗重度烧伤临床研究

目的:观察四君子汤联合乌司他丁注射液治疗重度烧伤患者的临床疗效及对血清炎症因子及补体C3、C4、B因子的影响。方法:选取重度烧伤患者96例,按随机数字表法分组,对照组患者48例予以常规治疗,研究组患者48例予以四君子汤和乌司他丁注射液治疗,采肘静脉血测定两组治疗前后血清炎症因子及补体C3、C4、B因子,检测血常规状况,对比临床疗效及不良反应。结果:对照组有效率为72.92%,研究组有效率为89.58%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,研究组治疗后血清肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、白细胞、中性粒细胞水平降低,血清白细胞介素-2、白细胞介素-10、补体C3、C4、B因子及血小板水平升高,差异均具有统计学意义(P<0.05);两组患者不良反应多为轻中度,患者能够耐受,对症处理后可缓解。结论:四君子汤联合乌司他丁注射液治疗重度烧伤患者疗效确切,能显著提高补体水平,降低炎症指标。     

PI3K/Akt信号通路在骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化调控中的作用

目的研究PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖及分化的影响。方法采用贴壁法体外分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),加入PI3K抑制剂LY294002(1、10μmol/L),应用MTT法测定细胞增殖,常规成骨诱导分化培养3或7 d,采用碱性磷酸酶(ALP)染色观察成骨分化水平,化学比色法测定ALP活性,茜素红染色后观察矿化钙结节数量并定量分析,Western blot检测磷酸化Akt蛋白表达,应用Realtime-PCR检测各组细胞BMP2、Runx2、OPN及Osterix等成骨分化标记物的基因表达水平。结果从24至72 h,LY294002对hMSCs增殖均产生显著抑制,随时间推延,可见抑制增殖效果增强(P<0.05)。ALP染色和定量测定提示10μmol/L的ALP活性最强,在不同时间显著高于对照组和1μmol/L组(P<0.05)。成骨诱导培养3和7 d,1、10μmol/L组矿化量都显著高于对照组(P<0.05)。10μmol/L组矿化量在成骨诱导7 d也显著高于1μmol/L组(P<0.05)。Western blot检测结果证实成骨诱导可激活Akt磷酸化蛋白表达,但LY294002可抑制该蛋白磷酸化。成骨诱导分化7 d,1、10μmol/L均明显促进BMP2、Runx2、OPN、Osterix 4种基因mRNA表达(均P<0.05)。结论 PI3K/Akt信号通路参与hMSCs增殖和分化过程。成骨分化伴随下游Akt蛋白表达。PI3K抑制剂可抑制hMSCs增殖,但同时促进其向成骨分化和矿化。