刺参精子冷冻保存方法研究

为获得适宜的刺参Apostichopus japonicus精子冷冻保存技术,综合借鉴现有水产动物精子冷冻保存方法,对刺参精子降温方式、冷冻保存液、精子与冷冻保存液混合比例及复苏温度进行了筛选,在筛选出适宜的刺参精子降温方式基础上,分别以煮沸消毒海水和超纯水为溶剂,加入葡萄糖、NaCl、KCl、海藻糖、无水CaCl_2和冷冻保存剂[二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Gly)或1,2-丙二醇(1,2-G)]配制冷冻保存剂终体积分数为5%、10%和15%的冷冻保存液(Aj-1～Aj-27),以体积比为1∶1、1∶2和1∶3的比例混合精子与冷冻保存液进行冷冻保存,冷冻48 h后分别在37℃和30℃水浴条件下进行精子复苏,以精子活率、快速运动时间和精子寿命为指标,综合筛选冷冻保存刺参精子的适宜冷冻保存液、精子与冷冻保存液混合比例及复苏温度。结果表明:将刺参精子与以超纯水为溶剂配制的Aj-20精子冷冻保存液(12 g/L葡萄糖、7 g/L NaCl、0.7 g/L KCl、5 g/L海藻糖、0.1 g/L无水CaCl_2和终体积分数为10%的DMSO)以体积比为1∶2的比例混合,以三步法降温方式冷冻保存,并在30℃水浴短时迅速复苏,该技术方法为本研究筛选到的最优刺参精子冷冻保存方法;与本研究中其他冷冻技术方法相比,应用该优选方法冷冻保存的刺参精子在复苏后精子活率最大(19.00±4.00)%、快速运动时间最长(1 178.67 s±14.57 s)、寿命最久(2 817.33 s±93.76 s);应用该优选方法冷冻保存72、120、408 h的精子复苏后受精率可达70%以上(精子与卵子数量比为1×10⁶∶1),受精的卵囊孵化率可达到50%。研究表明,本研究中筛选获得的冷冻保存液配方及其冷冻保存方法比较适宜刺参精子的长期冷冻保存,具有应用于生产实践的潜力。     

刺参精子冷冻保存方法研究

为获得适宜的刺参Apostichopus japonicus精子冷冻保存技术,综合借鉴现有水产动物精子冷冻保存方法,对刺参精子降温方式、冷冻保存液、精子与冷冻保存液混合比例及复苏温度进行了筛选,在筛选出适宜的刺参精子降温方式基础上,分别以煮沸消毒海水和超纯水为溶剂,加入葡萄糖、NaCl、KCl、海藻糖、无水CaCl_2和冷冻保存剂[二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Gly)或1,2-丙二醇(1,2-G)]配制冷冻保存剂终体积分数为5%、10%和15%的冷冻保存液(Aj-1～Aj-27),以体积比为1∶1、1∶2和1∶3的比例混合精子与冷冻保存液进行冷冻保存,冷冻48 h后分别在37℃和30℃水浴条件下进行精子复苏,以精子活率、快速运动时间和精子寿命为指标,综合筛选冷冻保存刺参精子的适宜冷冻保存液、精子与冷冻保存液混合比例及复苏温度。结果表明:将刺参精子与以超纯水为溶剂配制的Aj-20精子冷冻保存液(12 g/L葡萄糖、7 g/L NaCl、0.7 g/L KCl、5 g/L海藻糖、0.1 g/L无水CaCl_2和终体积分数为10%的DMSO)以体积比为1∶2的比例混合,以三步法降温方式冷冻保存,并在30℃水浴短时迅速复苏,该技术方法为本研究筛选到的最优刺参精子冷冻保存方法;与本研究中其他冷冻技术方法相比,应用该优选方法冷冻保存的刺参精子在复苏后精子活率最大(19.00±4.00)%、快速运动时间最长(1 178.67 s±14.57 s)、寿命最久(2 817.33 s±93.76 s);应用该优选方法冷冻保存72、120、408 h的精子复苏后受精率可达70%以上(精子与卵子数量比为1×10~6∶1),受精的卵囊孵化率可达到50%。研究表明,本研究中筛选获得的冷冻保存液配方及其冷冻保存方法比较适宜刺参精子的长期冷冻保存,具有应用于生产实践的潜力。     

中国对虾（Penaeusorientalis）胚胎及无节幼体低温贮存的初步研究

本文论述了用ＤＭＳＯ做为保护剂，消毒海水（盐度３０．４×１０^(－３)，ｐＨ８．６）为冷冻介质，对中国对虾胚胎及无节幼体的低温冷冻贮存方法进行的研究，当冷冻速度为１℃／ｍｉｎ时，解冻后，胚胎的完好率最高、达８４．５％（对照组９８．６％）．不同浓度的ＤＭＳＯ（５～５０×１０(－３)，ｐＨ８．６）为冷冻介质，对中国对虾胚胎及无节幼体的低温冷冻贮存方法进行的研究，当冷冻速度为１℃／ｍｉｎ时，解冻后，胚胎的完好率最高、达８４．５％（对照组９８．６％）．不同浓度的ＤＭＳＯ（５～５０×１０^(－２)）做为保护剂，以上述冷冻速度对胚胎进行冷冻，液氮中保存，其存活率均很低。Ｎ４、Ｎ５期幼体最适于低温冷冻贮存，当冷冻速度为１℃／ｍｉｎ、冷冻至－２０℃（ＤＭＳＯ浓度为７．０×１０(－２)）做为保护剂，以上述冷冻速度对胚胎进行冷冻，液氮中保存，其存活率均很低。Ｎ４、Ｎ５期幼体最适于低温冷冻贮存，当冷冻速度为１℃／ｍｉｎ、冷冻至－２０℃（ＤＭＳＯ浓度为７．０×１０^(－２)）保存，存活率为１００％，－４０℃（ＤＭＳＯ浓度为１６．７×１０(－２)）保存，存活率为１００％，－４０℃（ＤＭＳＯ浓度为１６．７×１０^(－２)）保存，存活率为７９．７％，至该温度后投入液氮中保存，成活率为３６．１％。其他各期无节幼体冷冻后存活率都很低。     

Na~+、K~+、Ca~(2+)、葡萄糖、pH、温度对北方须鳅精子活力的影响

为了解北方须鳅Barbatula barbatula nuda精子的生理特性,研究了不同离子浓度、葡萄糖浓度、pH、温度等因子的变化对性成熟北方须鳅(体质量为10～38 g)精子活力的影响。结果表明:Na⁺浓度为68 mmol/L时,北方须鳅精子活力最强,快速运动时间(FT)、寿命(LT)、激活率分别为(77±23)s、(495±154)s、95%;K+浓度为68 mmol/L时,北方须鳅精子活力最强,快速运动时间(FT)、寿命(LT)、激活率分别为(77±23)s、(495±154)s、95%;K⁺浓度为80 mmol/L时,精子活力最强,FT、LT和激活率分别为(68±10)s、(412±162)s和95%;Ca+浓度为80 mmol/L时,精子活力最强,FT、LT和激活率分别为(68±10)s、(412±162)s和95%;Ca⁽²⁺⁾浓度为50 mmol/L时,精子活力最强,FT、LT和激活率分别为(77±13)s、(281±26)s和95%;葡萄糖浓度为180 mmol/L时,北方须鳅精子活力最强,FT、LT和激活率分别为(88±11)s、(272±34)s和90%;在Tris或甘油溶液中,FT、LT和激活率均小于对照组;pH为3.0～5.0时精子不运动,pH为7.0时精子活力最强,FT、LT和激活率分别为(87±11)s、(128±17)s、90%;温度为5～20℃时,精子活力变化不显著;混合激活液A(Na(2+)浓度为50 mmol/L时,精子活力最强,FT、LT和激活率分别为(77±13)s、(281±26)s和95%;葡萄糖浓度为180 mmol/L时,北方须鳅精子活力最强,FT、LT和激活率分别为(88±11)s、(272±34)s和90%;在Tris或甘油溶液中,FT、LT和激活率均小于对照组;pH为3.0～5.0时精子不运动,pH为7.0时精子活力最强,FT、LT和激活率分别为(87±11)s、(128±17)s、90%;温度为5～20℃时,精子活力变化不显著;混合激活液A(Na⁺ 68 mmol/L、K+ 68 mmol/L、K⁺ 80 mmol/L 2种离子溶液的体积比为1∶1)及激活液B(Na+ 80 mmol/L 2种离子溶液的体积比为1∶1)及激活液B(Na⁺68 mmol/L、K+68 mmol/L、K⁺ 80 mmol/L、Ca+ 80 mmol/L、Ca⁽²⁺⁾ 50 mmol/L、葡萄糖180 mmol/L 4种离子溶液的体积比为1∶1∶1∶1)皆能提高精子活力,其FT、LT、精子激活率分别为(91±16)s、(552±90)s、95%,以及(112±17)s、(707±60)s、95%。研究表明,北方须鳅精子适宜的温度为5～20℃,适宜pH为7.0～8.0,Na(2+) 50 mmol/L、葡萄糖180 mmol/L 4种离子溶液的体积比为1∶1∶1∶1)皆能提高精子活力,其FT、LT、精子激活率分别为(91±16)s、(552±90)s、95%,以及(112±17)s、(707±60)s、95%。研究表明,北方须鳅精子适宜的温度为5～20℃,适宜pH为7.0～8.0,Na⁺、K+、K⁺、Ca+、Ca⁽²⁺⁾、葡萄糖对北方须鳅精子活力有增强效果,混合激活液B(Na(2+)、葡萄糖对北方须鳅精子活力有增强效果,混合激活液B(Na⁺ 68 mmol/L、K+ 68 mmol/L、K⁺ 80 mmol/L、Ca+ 80 mmol/L、Ca⁽²⁺⁾50 mmol/L、葡萄糖180 mmol/L 4种离子溶液的体积比为1∶1∶1∶1)效果最佳。     

冷冻胚胎的相关法律问题研究

冷冻胚胎是通过人工技术取得父体精子与母体卵子,在体外完成受精形成受精卵;冷冻胚胎在受精成功后,需要在特定的极冷环境中加以保存;冷冻胚胎可以同时保存多个受精胚胎,可以从中挑选质量较好的冷冻胚胎进行后续发育。本文结合冷冻胚胎存在的法律争议和国外的相关解决经验,提出了解决我国冷冻胚胎法律问题的建议。     

汽油液雾与低体积分数甲烷混合物爆炸特征研究

为了研究少量汽油液雾对低体积分数甲烷爆炸特征的影响,利用20 L球形爆炸测试装置,研究了1、2 mL汽油的液雾单独与空气混合的爆炸情况。通过改变甲烷体积分数,研究了甲烷分别与1、2 mL汽油的液雾混合后的爆炸特征,分析了汽油添加量对整个体系的爆炸下限影响。结果表明,汽油对甲烷-空气混合物爆炸影响非常显著,添加量分别为2、2.5、3 mL时,pmax分别是0.11、0.79、0.82 MPa,相应的（dp/dt）max分别是10.57、32.52、108.53 MPa/s。甲烷体积分数为6%时,汽油添加量为2 mL时,pmax是1.01 MPa,比添加1 mL汽油时增大31%,比未添加汽油时增大了320%。甲烷和汽油液雾混合后,其混合体系的爆炸下限低于各自在空气中的爆炸下限。1 mL汽油与空气混合物不发生爆炸,与体积分数≥3.5%的甲烷混合后能够发生爆炸。2 mL汽油与体积分数≥0.3%的甲烷混合,该体系依然能够发生爆炸。研究结果能够为封闭和半封闭空间中泄漏燃气与其他可燃性液体蒸气混合物的爆炸及预防提供数据支撑。     

取精后至冷冻前的间隔时间对精子冷冻复苏效果的影响

目的:探讨取精后至冷冻前的间隔时间对精子冷冻复苏率的影响,规范精液标本冷冻技术操作,进一步提高冻存标本的复苏率。方法:选取2015年3月在门诊行精液分析的30例参数正常精液标本,同一例精液一式3份,分别在精液取出后15、30 min及60 min后行精液冻存,即按所有样本按孵育时间的不同分为A(15 min)、B(30 min)、C(60 min)三组,每组30例。分析三组标本冷冻前后前向运动(PR)精子数、存活率及精子畸形率,比较各组精子的冷冻复苏率。结果:A组的PR精子冷冻复苏率(55.35±13.94)%及B组的(51.55±15.94)%均高于C组的(38.13±14.24)%,比较差异均有统计学意义(P<0.05);而A组与B组PR精子冷冻复苏率比较差异无统计学意义(P>0.05),但A组略高。三组精子存活率及正常形态精子百分率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:精子取出后应尽快完成冷冻,有助于提高精子冷冻复苏效果。     

超低温冷冻对俄罗斯鲟精子抗氧化酶活性的影响

为了探讨超低温(-196℃)对精子的损伤机理,采用试剂盒测定了冷冻前后俄罗斯鲟精浆和精子中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和谷胱甘肽还原酶(GR)等酶活性。结果表明,经过超低温冷冻保存后,俄罗斯鲟精子活力下降,添加抗冻保护液冷冻后的精浆中SOD、CAT、GSH-PX活性较鲜精组显著升高(P<0.05),较未添加保护液组显著降低(P<0.05),GR的活性则显著低于鲜精组(P<0.05),但显著高于未添加保护液组(P<0.05);添加抗冻保护液冷冻后的精子中SOD、CAT、GSH-PX活性较鲜精组显著降低(P<0.05),较未添加保护液组显著升高(P<0.05),GR活性则显著高于鲜精组(P<0.05),但显著低于未添加保护液组(P<0.05)。这说明超低温冷冻对俄罗斯鲟精子的抗氧化系统产生了较大影响,成为影响精子活力的一个重要原因。     

用响应面法优化小球藻絮凝沉降工艺的研究

以氢氧化钙为絮凝剂,对海水小球藻Chlorella vulgaris絮凝工艺效果进行了试验研究。单因素试验结果表明,当絮凝时间为60⁸0 min、氢氧化钙添加量为0.680 min、氢氧化钙添加量为0.6⁰.8 g/L和藻液pH为80.8 g/L和藻液pH为8¹0时,最有利于小球藻的采收。在单因素试验的基础上,利用响应面法对小球藻的絮凝条件进行了优化,建立了二次回归模型。通过分析得出:各因素对小球藻采收率均有极显著性影响(P<0.01),影响次序为氢氧化钙添加量>絮凝时间>藻液pH;絮凝时间与藻液pH以及氢氧化钙添加量与藻液pH的交互作用对小球藻采收率均有极显著性影响(P<0.01)。利用回归方程预测小球藻的最佳絮凝条件,当絮凝时间为77 min、氢氧化钙添加量为0.7 g/L、小球藻液pH为9.3时,小球藻的采收率可达93.9%。     

密度梯度离心联合上游法的精液处理在供精体外受精胚胎移植中的应用

目的:观察供精体外受精-胚胎移植术(D-IVF)中采用密度梯度离心法联合上游法处理精液后的胚胎情况。方法:回顾本院2013年1月-2014年7月D-IVF 135个周期,观察冷冻精液复苏后经采用密度梯度离心法联合上游法处理后精子总活动率、前向运动精子活动率等精液情况,以及受精以后的受精率、卵裂率、临床妊娠率,对照组为同期46个因丈夫梗阻性无精行ICSI的周期。结果:处理后精子总活动率、前向运动精子活动率均大大提高,但是精子密度却大大下降,处理前后比较差异均有统计学意义(P<0.05);受精以后的实验室资料和对照组比较,各项参数差异无统计学意义(P>0.05)。结论:密度梯度离心法联合上游法的精液处理方法在D-IVF中是一种稳定可行的方法。